Основная задача, которая решается механической частью, достаточно проста - обеспечение крепления и движения оптической части микроскопа и объекта.
Предметные столики предназначены для крепления в определенном положении объекта наблюдения. Основные требования связаны с жесткостью крепления самих столиков, а также с фиксацией и координацией (ориентацией) объекта (препарата) относительно объектива.
Стол крепится на специальном кронштейне. Для удобства работы столики конструктивно выполняются неподвижными и подвижными.
Неподвижные столики обычно применяются в самых простейших моделях микроскопов. Движение объекта на них осуществляется с помощью рук наблюдателя для быстроты перемещения при экспрес-диагностике. Препарат закрепляется на столике с помощью пружинящих лапок или с помощью специального устройства препаратодержателя.
Для механического перемещения или вращения объекта под объективом микроскопа применяются подвижные (рис. 32) столики. Препарат фиксируется и перемещается с помощью препаратоводителя. Координатное перемещение объекта по двум осям X-Y (или только по одной X) осуществляется с помощью рукоятки (обычно сдвоенной коаксиальной) вручную или от электродвигателя (обычно шагового). Последние носят название "сканирующие столики. На столе вдоль направляющих по осям X и Y расположены шкалы с нониусами для контроля положения и линейного измерения перемещения в горизонтальной плоскости.
Фокусировочный механизм: грубая и точная фокусировка. Фокусировочный механизм обеспечивает движение стола или объектива для установки определенного расстояния между объектом наблюдения и оптической частью микроскопа. Это расстояние гарантирует резкое изображение объекта. "Наводка на резкость" осуществляется двумя регулировками – грубой и точной. Каждая регулировка – это свой механизм и своя рукоятка. Рукоятки управления могут быть разнесены или совмещены, но обязательно располагаются по бокам микроскопа: справа и слева попарно.
Обычно грубая фокусировка (регулировка) осуществляется парой больших рукояток (рис. 31), расположенных по обе стороны от штатива. Они совершают "черновое" движение объектива к объекту или от него. Минимальная величина перемещения составляет 1 мм за один оборот. При этом грубая фокусировка является рабочей при тех исследованиях, где увеличение микроскопа не более 400 х.
Точная фокусировка (регулировка) осуществляется парой небольших рукояток, которые обычно за один оборот придвигают стол или объектив к объекту на 0,01 -0,05 мм. Величина перемещения за один оборот зависит от конструктивных особенностей микроскопов различных фирм.
Как правило, на одну из рукояток точной фокусировки наносится шкала, которая позволяет контролировать вертикальное перемещение микроскопа относительно объекта наблюдения.
Например, отечественный микроскоп МИКМЕД-2 имеет грубое фокусировочное перемещение до 30 мм, при этом один оборот рукоятки обеспечивает перемещение на 2,5 мм, точная фокусировка осуществляется в пределах 2,5 мм при одном обороте на 0,25 мм, на одну из рукояток точной фокусировки нанесена шкала с ценой деления 0,002 мм.
Функциональное назначение фокусировочного перемещения значительно больше, чем обычно ему отводится. Без точной фокусировки не обойтись:
Если увеличение микроскопа более 400 х;
При работе с иммерсионными объективами;
При работе с объективами, которые не дают резкого изображения по всему наблюдаемому полю;
Если на всем видимом поле объект неровный по толщине или имеет объем.
Совмещение (коаксиальное расположение) обеих рукояток значительно упрощает работу, одновременно усложняя конструкцию и удорожая микроскоп.
Узел крепления и перемещения конденсора. Конденсор , как самостоятельный узел, является стыкующим элементом между осветительной системой (источником света) и микроскопом (объективом и визуализирующей частью).
Узел крепления конденсора расположен под предметным столиком. Имеет вид кронштейна с гнездом. Предназначен для установки конденсора, его фиксации и центрировки, т. е. перемещения в горизонтальной плоскости перпендикулярно оптической оси микроскопа.
Кроме того, узел имеет направляющую для фокусировочного движения (перемещения) конденсора по вертикали, вдоль оптической оси.
Каким бы образом конденсор ни устанавливался в гнезде - сбоку, сверху или снизу, - он жестко крепится с помощью стопорного винта, который предотвращает его выпадение, с одной стороны, и обеспечивает центрированное положение в процессе работы, с другой.
Центровочные винты обеспечивают совмещение осветительного пучка от источника света и оптической оси микроскопа (настройка освещения по Келеру). Это очень важный этап настройки освещения в микроскопе, влияющий на равномерность освещения и точность воспроизведения объекта, а также на контраст и разрешение элементов в изображении объекта.
Фокусировка (настройка по высоте) конденсора осуществляется с помощью ручки на кронштейне и, так же как центрировка, влияет на работу всей оптической части микроскопа.
Конденсор может быть неподвижным. Обычно подобная конструкция присуща учебным микроскопам . Эти микроскопы применяются при рутинной работе, где не требуется применение дополнительных методов контрастирования, и объект не требует более детального исследования.
Узел крепления объективов. Существует несколько типов крепления объективов в микроскопе:
Ввинчивание объектива непосредственно в тубус (как правило, на учебных «школьных» микроскопах);
"салазки" - крепление объективов с помощью специального безрезьбового устройства (направляющей);
Револьверное устройство с несколькими гнездами.
В настоящее время самым распространенным типом крепления объективов является револьверное устройство (револьверная головка) (рис. 33).
Узел крепления объективов в виде револьверного устройства выполняет следующие функции:
Смену увеличения в микроскопе за счет вращения головки, в каждое гнездо которой ввинчивается объектив определенного увеличения;
Фиксированную установку объектива в рабочее положение;
гарантированное центрирование оптической оси объектива относительно оптической оси микроскопа в целом, включая осветительную систему.
Револьверное устройство может быть 3-х, 4-х, 5-ти, 6-ти или 7-гнездным в зависимости от класса сложности микроскопа и решаемых им задач.
В микроскопах, где применяется дифференциально-интерференционный контраст, в револьверной головке над гнездом имеется один или несколько пазов для установки направляющей с призмой.
В учебных микроскопах объективы обычно крепятся таким образом, чтобы замена их была затруднена (т. е. делаются несъемными).
Порядок следования объективов должен строго соблюдаться: от меньшего увеличения к большему, при этом движение револьверной головки осуществляется по часовой стрелке.
Как правило, при сборке микроскопов производится операция подбора объективов - комплектация . Это позволяет не терять изображение объекта из поля зрения при переходе от одного увеличения к другому.
И еще одно условие должно обеспечивать револьверное устройство - парфокальность . Гнездо револьвера, вернее, его внешняя поверхность, является материальной базовой поверхностью для отсчета высоты объектива и длины тубуса объектива (микроскопа). Объектив должен быть ввинчен в гнездо таким образом, чтобы между ним и револьверной головкой не было зазора. При этом обеспечиваются расчетные значения всех сборочных оптических элементов в микроскопе, а также конструктивное и технологическое их обеспечение. Это значит, что если будет получено резкое изображение объекта с одним объективом, то при переходе к другому в пределах глубины резкости объектива резкое изображение объекта сохраняется.
Парфокальность в комплекте объективов обеспечивается конструкцией микроскопа и технологией изготовления. При отсутствии этого условия при переходе от одного объектива к другому требуется значительная подфокусировка по резкости изображения.
Узел крепления окуляров (тубуса) в современных микроскопах представляет собой кронштейн с гнездом, в которое устанавливаются различные виды насадок: визуальные насадки (монокулярные и бинокулярные (рис. 34)), фотометрические и спектрофотометрические , микрофото - и адаптерные устройства для видеосистем . Кроме того, в это гнездо могут быть установлены: насадки сравнения , рисовальные аппараты , экранные насадки , а также осветители падающего света . Фиксация устройств осуществляется стопорным винтом.
Невозможно представить модель современного микроскопа без системы документирования
. Практически это бинокулярная насадка с выходом на фото- или телесистему.
Конструктивно узел крепления окуляров может быть снабжен дополнительным оптико-механическим модулем сменного увеличения, получившего название "Оптовар" (Optovar). Как правило, он имеет несколько ступеней увеличения от меньшего единицы до 2,5 х, но есть варианты и с одной ступенью. Обычно модуль располагается между визуальной насадкой и револьверным устройством, обеспечивая тем самым дополнительное увеличение, как для визуального канала, так и для фотовыхода. Конечно, наибольшее значение это имеет для фотоканала.
ОПТИКА МИКРОСКОПА
Оптические узлы и принадлежности обеспечивают основную функцию микроскопа – создание увеличенного изображения рассматриваемого объекта с достаточной степенью достоверности по форме, соотношению размеров и цвету. Кроме того, оптика микроскопа должна обеспечивать такое увеличение, контраст и разрешение элементов, которые позволят произвести наблюдение, анализ и измерение, соответствующие требованиям методик клинико-диагностической практики.
Основными оптическими элементами микроскопа являются: объектив , окуляр , конденсор . Вспомогательными элементами – осветительная система , оптовар, визуальные и фотонасадки с оптическими адаптерами и проективами.
Объектив микроскопа предназначен для создания увеличенного изображения рассматриваемого объекта с требуемым качеством, разрешением и цветопередачей.
Классификация объективов достаточно сложна и связана с тем, для изучения каких объектов предназначен микроскоп, зависит от требуемой точности воспроизведения объекта с учетом разрешающей способности и цветопередачи в центре и по полю видения.
Современные объективы имеют сложную конструкцию, количество линз в оптических системах доходит до 7-13. При этом расчеты базируются в основном на стеклах с особыми свойствами и кристалле флюорите или стеклах, аналогичных ему по основным физико-химическим свойствам.
По степени исправления аберраций выделяют несколько типов объективов:
Исправленные в спектральном диапазоне:
Монохроматические объективы (монохроматы) рассчитаны для применения в узком спектральном диапазоне, практически они хорошо работают в одной длине волны. Аберрации исправлены в узком спектральном диапазоне. Монохроматы были широко распространены в 60-х годах в период развития фотометрических методов исследования и создания аппаратуры для исследований в ультрафиолетовой (УФ) и инфракрасной (ИК)областях спектра.
Ахроматические объективы (ахроматы) рассчитаны для применения в спектральном диапазоне 486-656 нм. В этих объективах, устранены сферическая аберрация, хроматическая аберрация положения для двух длин волн (зеленого и желтого участков спектра), кома, астигматизм и частично сферохроматическая аберрация.
Изображение объекта имеет несколько синевато-красноватый оттенок. Технологически объективы достаточно просты – небольшое количество линз, технологичные для изготовления марки стекол, радиуса, диаметры и толщины линз. Относительно дешевые. Входят в комплект микроскопов, которые предназначены для рутинных работ и обучения.
В связи с простотой конструкции (всего 4 линзы) ахроматы имеют следующие достоинства:
Высокий коэффициент светопропускания, что необходимо при проведении фотометрических измерений и люминесцентных исследованиях;
Обеспечение трудно сочетаемых при расчете условий: большое рабочее расстояние при работе объектива с покровным стеклом, явно превышающим стандартнуютолщину и при этом - желание сохранения разрешающей способности, что необходимо при работе на инвертированных микроскопах.
К недостаткам можно отнеси то, что полевые аберрации в чистых ахроматах исправлены чаще всего на 1/2-2/3 поля, т.е. без перефокусировки возможно наблюдение в пределах 1/2-2/3 по центру видения. Это увеличивает время наблюдения, т.к. требует постоянной перефокусировки на край поля.
Апохроматические объективы . Уапохроматов спектральная область расширена и ахроматизация выполняется для трех длин волн. Кроме хроматизма положения, сферической аберрации, комы и астигматизма, достаточно хорошо исправляются также вторичный спектр и сферохроматическая аберрация.
Развитие этот тип объективов получил после того, как в оптическую схему объектива стали вводится линзы из кристаллов и специальных стекол. Количество линз в оптической схеме апохромата доходит до 6. По сравнению с ахроматами, апохроматы обычно имеют повышенные числовые апертуры, дают четкое изображение и точно передают цвет объекта.
Полевые аберрации в чистых апохроматах исправлены даже меньше чем у ахроматов, чаще всего на 1/2 поля, т.е. без перефокусировки возможно наблюдение в пределах 1/2 по центру видения.
Апохроматы обычно применяются при особо тонких и важных исследованиях и особенно там, где требуется качественная микрофотография.
Изучение клеток микроорганизмов, невидимых невооруженным глазом, возможно только при помощи микроскопов. Эти приборы позволяют получать изображение исследуемых объектов, увеличенное в сотни раз (световые микроскопы), в десятки и сотни тысяч раз (электронные микроскопы).
Биологический микроскоп называется световым, так как он обеспечивает возможность изучать объект в проходящем свете в светлом и темном поле зрения.
Основными элементами современных световых микроскопов являются механическая и оптическая части (рис. 1).
К механической части относятся штатив, тубус, револьверная насадка, коробка микромеханизма, предметный столик, макрометрический и микрометрический винты.
Штатив состоит из двух частей: основания и тубусодержателя (колонки). Основание микроскопа прямоугольной формы имеет снизу четыре опорные площадки, что обеспечивает устойчивое положение микроскопа на поверхности рабочего стола. Тубусодержатель соединяется с основанием и может перемещаться в вертикальной плоскости при помощи макро- и микрометрического винтов. При вращении винтов по часовой стрелке тубусодержатель опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается от препарата. В верхней части тубусодержателя укреплена головка с гнездом для монокулярной (или бинокулярной) насадки и направляющей для револьверной насадки. Головка крепится винтом .
Тубус – это труба микроскопа, позволяющая поддерживать определенное расстояние между основными оптическими деталями – окуляром и объективом. Вверху в тубус вставляется окуляр. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус.
Револьверная насадка представляет собой вогнутый диск с несколькими гнездами, в которые ввинчиваются 3– 4 объектива. Вращая револьверную насадку, можно быстро установить любой объектив в рабочее положение под отверстие тубуса.
Рис. 1. Устройство микроскопа:
1 – основание; 2 – тубусодержатель; 3 – тубус; 4 – окуляр; 5 – револьверная насадка; 6 – объектив; 7 – предметный столик; 8 – клеммы, прижимающие препарат; 9 – конденсор; 10 – кронштейн конденсора; 11 – рукоятка перемещения конденсора; 12 – откидная линза; 13 – зеркало; 14 – макровинт; 15 – микровинт; 16 – коробка с механизмом микрометрической фокусировки; 17 – головка для крепления тубуса и револьверной насадки; 18 – винт для крепления головки
Коробка микромеханизма несет с одной стороны направляющую для кронштейна конденсора, а с другой – направляющую для тубусодержателя. Внутри коробки находится механизм фокусировки микроскопа, представляющий собой систему зубчатых колес.
Предметный столик служит для размещения на нем препарата или другого объекта исследования. Столик может быть квадратным или круглым, подвижным или неподвижным. Подвижный столик перемещается в горизонтальной плоскости при помощи двух боковых винтов, что позволяет рассматривать препарат в разных полях зрения. На неподвижном столике для обследования объекта в разных полях зрения препарат перемещают рукой. В центре предметного столика имеется отверстие для освещения снизу лучами света, направляемыми от осветителя. На столике имеются две пружинные клеммы , предназначенные для закрепления препарата.
Некоторые системы микроскопов снабжены препаратоводителем, необходимым при исследовании поверхности препарата или при подсчете клеток. Препаратоводитель позволяет производить передвижение препарата в двух взаимно-перпендикулярных направлениях. На препаратоводителе имеется система линеек – нониусов, с помощью которых можно присвоить координаты любой точке исследуемого объекта.
Макрометрический винт (макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта. При вращении макровинта по часовой стрелке тубус микроскопа опускается, при вращении против часовой стрелки – поднимается.
Микрометрический винт (микровинт) используют для точной установки изображения объекта. Микрометрический винт является одной из наиболее легко повреждаемых частей микроскопа, поэтому с ним надо обращаться осторожно – не вращать с целью грубой установки изображения во избежание самопроизвольного опускания тубуса. При полном повороте микровинта тубус передвигается на 0,1 мм.
Оптическая часть микроскопа состоит из основных оптических деталей (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор).
Объективы (от лат. objektum – предмет) – наиболее важная, ценная и хрупкая часть микроскопа. Они представляют собой систему линз, заключенных в металлическую оправу, на которой указаны степень увеличения и числовая апертура. Наружная линза, обращенная плоской стороной к препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы называются коррекционными и служат для устранения недостатков оптического изображения, возникающих при рассмотрении исследуемого объекта.
Объективы бывают сухие и иммерсионные, или погружные. Сухим называется объектив, у которого между фронтальной линзой и рассматриваемым объектом находится воздух. Сухие объективы обычно имеют большое фокусное расстояние и увеличение 8х или 40х. Иммерсионным (погружным) называют объектив, у которого между фронтальной линзой и препаратом находится специальная жидкая среда. Вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей преломляется и не попадает в глаз наблюдателя. В результате этого изображение получается нечетким, более мелкие структуры остаются невидимыми. Избежать рассеивания светового потока можно путем заполнения пространства между препаратом и фронтальной линзой объектива веществом, показатель преломления которого близок к коэффициенту преломления стекла. К таким веществам относятся глицерин (1,47), кедровое (1,51), касторовое (1,49), льняное (1,49), гвоздичное (1,53), анисовое масло (1,55) и другие вещества. Иммерсионные объективы имеют на оправе обозначения: I (immersion ) – иммерсия, Н I (homogen immersion ) – однородная иммерсия, OI (oil immersion ) или МИ – масляная иммерсия. В настоящее время в качестве иммерсионной жидкости чаще используют синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу.
Объективы различают по их увеличению. Величина увеличения объективов обозначена на их оправе (8х, 40х, 60х, 90х). Кроме того, каждый объектив характеризуется определенной величиной рабочего расстояния. Для иммерсионного объектива это расстояние составляет 0,12 мм, для сухих объективов с увеличением 8х и 40х – 13,8 и 0,6 мм соответственно.
Окуляр (от лат. okularis – глазной) состоит из двух линз – глазной (верхней) и полевой (нижней), заключенных в металлическую оправу. Окуляр служит для увеличения изображения, которое дает объектив. Увеличение окуляра обозначено на его оправе. Существуют окуляры с рабочим увеличением от 4х до 15х.
При длительной работе с микроскопом следует пользоваться бинокулярной насадкой. Корпуса насадки могут раздвигаться в пределах 55–75 мм в зависимости от расстояния между глазами наблюдателя. Бинокулярные насадки часто имеют собственное увеличение (около 1,5х) и коррекционные линзы.
Конденсор (от лат. condenso – уплотняю, сгущаю) состоит из двух-трех короткофокусных линз. Он собирает лучи, идущие от зеркала, и направляет их на объект. При помощи рукоятки, расположенной под предметным столиком, конденсор может перемещаться в вертикальной плоскости, что приводит к увеличению освещенности поля зрения при поднятом конденсоре и уменьшению его при опущенном конденсоре. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре имеется ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок. При полностью открытой диафрагме рекомендуется рассматривать окрашенные препараты, при уменьшенном отверстии диафрагмы – неокрашенные. Под конденсором расположена откидная линза в оправе, используемая при работе с объективами малого увеличения, например, 8х или 9х.
Зеркало имеет две отражающие поверхности – плоскую и вогнутую. Оно закреплено на шарнирах в основании штатива и его можно легко поворачивать. При искусственном освещении рекомендуется пользоваться вогнутой стороной зеркала, при естественном – плоской.
Осветитель выполняет функциюискусственногоисточника света. Он состоит из низковольтной лампы накаливания, закрепляющейся на штативе, и понижающего трансформатора. На корпусе трансформатора имеется рукоятка реостата, регулирующего накал лампы и тумблер для включения осветителя.
Во многих современных микроскопах осветитель вмонтирован в основание.
Светлопольная микроскопия
Изучение невидимых невооруженным глазом клеток микроорганизмов, размеры которых не превышают десятков и сотен микрометров (1 мкм = 0,001 мм), возможно только при помощи микроскопов (от греч. mikros - малый, skopeo - смотрю). Эти приборы позволяют получать в сотни раз (световые микроскопы) и в десятки-сотни тысяч раз (электронные микроскопы) увеличенное изображение исследуемых объектов.
При помощи микроскопа изучают морфологию клеток микроорганизмов, их рост и развитие, проводят первичную идентификацию (от лат. idenificare - отождествление) исследуемых организмов, ведут наблюдения за характером развития микробных ценозов (сообществ) в почве и других субстратах.
Микроскоп состоит из двух частей: механической (подсобной) и оптической (главной).
Механическая часть микроскопа. К ней относят штатив, предметный столик и тубус (трубу).
Штатив имеет основание в виде подковы и колонку (тубусодержатель) в форме дуги. К нему примыкают коробка механизмов, система зубчатых колес для регуляции положения тубуса. Система приводится в движение вращением макрометрического и микрометрического винтов.
Микрометрический винт (кремальера, зубчатка, макровинт) служит для предварительной ориентировочной установки изображения рассматриваемого объекта.
Микрометрический винт (микровинт) используют для последующей четкой установки на фокус. При полном повороте микровинта труба передвигается на 0,1 мм (100 мкм).
При вращении винтов по часовой стрелке труба опускается по направлению к препарату, при вращении против часовой стрелки - поднимается от препарата.
Предметный столик служит для размещения на нем препарата с объектом исследования. Предметный столик вращается и перемещается во взаимно перпендикулярных плоскостях с помощью винтов. В центре столика находится круглое отверстие для освещения препарата снизу лучами света, направляемыми зеркалом микроскопа. В столик вмонтированы два зажима (клеммы) - пружинящие металлические пластинки, предназначенные для закрепления препарата.
Если необходимо исследовать поверхность препарата, не допуская пропусков (что важно при подсчете), или же если во время работы требуется повторное исследование какого-либо определенного участка на препарате, на предметный столик помешают препаратоводитель. На нем имеется система линеек - нониусов, с помощью которых можно присвоить координаты любой точке исследуемого объекта. Для этого при установке препаратоводителя следует совместить центр вращения столика и оптическую ось системы микроскопа с центрировочной пластинкой препаратоводителя (отсюда предметный столик с препаратоводителем называют иногда крестообразным).
Тубус (труба) - оправа, в которую заключены элементы оптической системы микроскопа. К нижней части тубуса прикрепляется револьвер (объективодержатель) с гнездами для объективов. Современные модели микроскопов имеют наклонный тубус с дугообразным тубусодержателем, что обеспечивает горизонтальное положение предметного столика.
Оптическая часть микроскопа состоит из основного оптического узла (объектив и окуляр) и вспомогательной осветительной системы (зеркало и конденсор). Все части оптической системы строго центрированы относительно друг друга. Во многих современных микроскопах зеркало и конденсор заменены вмонтированным в прибор регулируемым источником света.
Осветительная система находится под предметным столиком. Зеркало отражает падающийна него свет в конденсор. Одна сторона зеркала плоская, другая - вогнутая.При работес конденсором необходимо пользоватьсятолько плоским зеркалом. Вогнутое зеркало применяют при работе безконденсора с объективами малых увеличений. Конденсор (oт лат. condenso - уплотняю, сгущаю), состоящий из 2-3 короткофокусныхлинз, собирает лучи, идущие от зеркала, и направляетих на объект. Конденсор необходим, прежде всего, при работес иммерсионной системой. Линзы конденсора вмонтированы в металлическую оправу, соединенную с зубчатым механизмом, позволяющим перемещать конденсор вверх и вниз специальным винтом. Для регулировки интенсивности освещения в конденсоре есть ирисовая (лепестковая) диафрагма, состоящая из стальных серповидных пластинок
Окрашенные препараты лучше рассматриватьпри почтиполностью открытой диафрагме, неокрашенные - при уменьшенном отверстии диафрагмы.
Под конденсором располагается кольцевидный держатель для светофильтров (обычно к микроскопу прилагаются синееи белое матовые стекла). При работе с искусственным источникомсвета светофильтры создают впечатление дневного освещения, что делает микроскопирование менее утомительнымдля глаз.
Объектив (от лат. objectum - предмет) - наиболее важнаячасть микроскопа. Это многолинзовая короткофокуснаясистема, от качества которой зависит в основном изображениеобъекта. Наружная линза, обращеннаяплоской сторонойк препарату, называется фронтальной. Именно она обеспечивает увеличение. Остальные линзы в системе объектива выполняют преимущественно функции коррекции оптических недостатков, возникающих при исследовании объектов.
Один из таких недостатков - явление сферическойаберрации. Оно связано со свойством линз неравномернопреломлять периферические и центральныелучи. Первые обычно преломляются в большей степени, чем вторые, ипоэтому пересекаются на более близком расстоянии к линзе.В результате изображение точки приобретаетвид расплывчатогопятна.
Хроматическая аберрация возникаетпри прохождении через линзу пучка лучей с различной длиной волны. Преломляясь по-разному, лучи пересекаются не в одной точке. Сине-фиолетовые лучи с короткой длиной волны преломляются сильнее, чем красные с большей длиной волны. Вследствие этого у бесцветного объекта появляется окраска.
К объективам, устраняющим сферическую и частично хроматическую аберрацию, относятся ахроматы. Они содержат до 6 линз и корригируют первичный спектр (желто-зеленую часть спектра), не устраняя вторичного спектра. Изображение, получаемое с помощью ахроматов, не окрашено, но края его имеют красный пли синеватый ореол. В современных ахроматах этот недостаток практически неуловим. Лучший материал для линз ахроматов - флинтгласы - старые сорта стекли с высоким содержанием окиси свинца.
Объективы, устраняющие хроматическую аберрцию и для вторичного спектра, называют апохроматами. В их составе может быть oт 1 до 12 линз. Линзы апохроматов для лучшей коррекции вторичного спектра делают из плавикового шпата, каменной соли, квасцов и других материалов. Апохро-маты дают возможность устранить окрашивание объекта и получить одинаково резкое изображение от лучей разного цвета. Максимального эффекта при работе с апохроматами можно достичь только при их сочетании с компенсационными окулярами, возмещающими оптические недостатки объективов. В компенсационных окулярах хроматическая ошибка противо положна хроматической ошибке объектива, и в результате хроматическая аберрация микроскопа оказывается почти полностью компенсированной.
Планахроматы - paзновидность апохроматов, имеющих плоское полe зрения. Объективы-планахроматы полностью устраняют искривление поля зрения, обуславливающее неравномерность фокусировки объекта (при кривизне поля зрения фокусируется только часть поля). Планахроматы и планапохроматы используют при микрофотографии.
Объективы бывают сухие и погружные (иммерсионные). При работе с сухими объективами между фронтальной линзой объектива и объектом исследования находится воздух. Оптический расчет иммерсионных объективов предусматривает их работу при погружении фронтальной линзы объектива в жидкую однородную среду. При работе с сухим объективом вследствие разницы между показателями преломления стекла (1,52) и воздуха (1,0) часть световых лучей отклоняется и не попадает в глаз наблюдателя (рис. 1).При работе с иммерсионным объективом необходимо поместить между покровным стеклом и линзами объектива кедровое
масло, показатель преломления которого близок к показателю преломления стекла (табл. 1).
Лучи в оптически однородной гомогенной среде не меняют своего направления. Иммерсионные объективы на оправе имеют черную круговую нарезку и обозначения: I - immersion (иммерсия), HI - homogen immersion (однородная иммерсия), OI - oil immersion, МИ - масляная иммерсия. Объективы различают по их увеличению.
Собственное увеличение объектива (V) определяют по формуле
где l - оптическая длина тубуса или расстояние между фокальной плоскостью объектива и плоскостью изображения, составляющее для разных объективов 128-180 мм; f - фокусное расстояние объектива: чем оно больше, тем меньше увеличение объектива.
Величина увеличения объективов обозначена на их оправе (8х, 40х, 9х). Каждый объектив характеризуется, кроме того, определенной величиной рабочего расстояния в миллиметрах.
У объективов с малым увеличением расстояние от фронтальной линзы объектива до препарата больше, чем у объективов с большим увеличением. Так, объективы с увеличением 8 х, 40 х и 90 х имеют соответственно рабочие расстояния 13,8; 0,6 и 0,12 мм. В зависимости от того, с каким объективом работаешь, для его фокусировки выбирается макрометрический и микрометрический винт. Иммерсионный объектив имеет рабочее расстояние до объектива 0,12 мм, поэтому его нередко называют «близоруким».
1 Кедровое масло получают из семян виргинского можжевельника Juniperus virginiana или зеравшанской арчи Juniperus seravschana. В настоящее время в качестве иммерсионной жидкости чаще применяют синтетические продукты, соответствующие по оптическим свойствам кедровому маслу.
Специальные виды микроскопии
Темнопольная. Используют специальный конденсор, выделяющий контрастирующие структуры неокрашенного материала. Темнопольная микроскопия позволяет наблюдать живые объекты. Наблюдаемый объект выглядит как освещенный на темном поле. При этом лучи от осветителя падают на объект сбоку, а в линзы микроскопа поступают только рассеянные лучи.
Фазово-контрастная микроскопия позволяет изучать живые и неокрашенные объекты. При прохождении света через окрашенные объекты изменяется амплитуда световой волны, а при прохождении света через неокрашенные – фаза световой волны, что и используют для получения высококонтрастного изображения в фазово-контрастной и интерференционной микроскопии.
Поляризационная микроскопия - формирование изображения неокрашенных анизотропных структур (например, коллагеновые волокна и миофибриллы).
Интерференционная микроскопия объединяет принципы фазово-контрастной и поляризационной микроскопии и применяется для получения контрастного изображения неокрашенных объектов.
Люминесцентная микроскопия применяется для наблюдения флюоресцирующих (люминесцирующих) объектов. В люминесцентном микроскопе свет от мощного источника проходит через два фильтра. Один фильтр задерживает свет перед образцом и пропускает свет длины волны, возбуждающей флюоресценцию образца. Другой фильтр пропускает свет длины волны, излучаемой флуоресцирующим объектом. Таким образом, флюоресцирующие объекты поглощают свет одной длины волны и излучают в другой области спектра.
Флюоресцирующие красители (флюоресцин, родамин и др.) избирательно связываются со специфическими макромолекулами.
Электронная микроскопия
Теоретическое разрешение просвечивающего ЭМ составляет 0,002 нм. Реальное разрешение современных микроскопов приближается к 0,1 нм. Для биологических объектов разрешение ЭМ на практике составляет 2 нм.
Просвечивающий ЭМ состоит из колонны, через которую в вакууме проходят электроны, излучаемые катодной нитью. Пучок электронов, фокусируемый кольцевыми магнитами, проходит через подготовленный образец. Характер рассеивания электронов зависит от плотности образца. Проходящие через образец электроны фокусируют, наблюдают на флюоресцирующем экране и регистрируют при помощи фотопластинки.
Сканирующий ЭМ применяют для получения трехмерного изображения поверхности исследуемого объекта.
Метод сколов ( замораживания-скалывания) применяют для изучения внутреннего строения клеточных мембран. Клетки замораживают при температуре жидкого азота в присутствии криопротектора и используют для изготовления сколов. Плоскости скола проходят через гидрофобную середину двойного слоя липидов. Обнаженную внутреннюю поверхность мембран оттеняют платиной, полученные реплики изучают в сканирующем электронном микроскопе.
2.Основные части светового микроскопа их назначение и устройство
Разрешающая способность микроскопа дает раздельное изображение двух близких друг другу линий. Невооруженный человеческий глаз имеет разрешающую способность около 1/10 мм или 100 мкм. Лучший световой микроскоп примерно в 500 раз улучшает возможность человеческого глаза, т. е. его разрешающая способность составляет около 0,2 мкм или 200 нм.
Разрешающая способность и увеличение не одно и тоже. Если с помощью светового микроскопа получить фотографии двух линий, расположенных на расстоянии менее 0,2 мкм, то, как бы не увеличивать изображение, линии будут сливаться в одну. Можно получить большое увеличение, но не улучшить его разрешение.
Различают полезное и бесполезное увеличения. Под полезным понимают такое увеличение наблюдаемого объекта, при котором можно выявить новые детали его строения. Бесполезное - это увеличение, при котором, увеличивая объект в сотни и более раз, нельзя обнаружить новых деталей строения. Например, если изображение, полученное с помощью микроскопа (полезное!), увеличить еще во много раз, спроецировав его на экран, то новые, более тонкие детали строения при этом не выявятся, а лишь соответственно увеличатся размеры имеющихся структур.
В учебных лабораториях обычно используют световые микроскопы, на которых микропрепараты рассматриваются с использованием естественного или искусственного света. Наиболее распространены световые биологические микроскопы: БИОЛАМ, МИКМЕД, МБР (микроскоп биологический рабочий), МБИ (микроскоп биологический исследовательский) и МБС (микроскоп биологический стереоскопический). Они дают увеличение в пределах от 56 до 1350 раз. Стереомикроскоп (МБС) обеспечивает подлинно объемное восприятие микрообъекта и увеличивает от 3,5 до 88 раз.
В микроскопе выделяют две системы: оптическую и механическую К оптической системе относят объективы, окуляры и осветительное устройство (конденсор с диафрагмой и светофильтром, зеркало или электроосветитель).
Механическая часть микроскопа.
основание (штатив) или массивная ножка (1);
коробка с микромеханизмом (2) и микровинтом (3);
податочный механизм для грубой наводки – макровинт или кремальера (8);
предметный столик (4);
винты (5, 6, 12, 13);
головка (9); револьвер (10); клеммы; тубус (11);
дуга или тубусодержвтель(7);
Кремальера (макровинт) – служит для приблизительной «грубой» установки на фо-
Механическая система микроскопа состоит из подставки, коробки с микрометренным механизмом и микрометренным винтом, тубуса, тубусодержателя, винта грубой наводки, кронштейна конденсора, винта перемещения конденсора, револьвера, предметного столика.
Подставка - это основание микроскопа.
Коробка с микрометренным механизмо м, построенном на принципе взаимодействующих шестерен, прикреплена к подставке неподвижно. Микрометренный винт служит для незначительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива на расстояния, измеряемые микрометрами. Полный оборот микрометренного винта передвигает тубусодержатель на 100 мкм, а поворот на одно деление опускает или поднимает тубусодержатель на 2 мкм. Во избежание порчи микрометренного механизма разрешается крутить микрометренный винт в одну сторону не более чем на половину оборота.
Тубус или трубка - цилиндр , в который сверху вставляют окуляры. Тубус подвижно соединен с головкой тубусодержателя, его фиксируют стопорным винтом в определенном положении. Ослабив стопорный винт, тубус можно снять.
Револьвер предназначен для быстрой смены объективов, которые ввинчиваются в его гнезда. Центрированное положение объектива обеспечивает защелка, расположенная внутри револьвера.
Винт грубой наводки используют для значительного перемещения тубусодержателя, а, следовательно, и объектива с целью фокусировки объекта при малом увеличении.
Предметный столик предназначен для расположения на нем препарата. В середине столика имеется круглое отверстие, в которое входит фронтальная линза конденсора. На столике имеются две пружинистые клеммы - зажимы, закрепляющие препарат.
Кронштейн конденсора подвижно присоединен к коробке микрометренного механизма. Его можно поднять или опустить при помощи винта, вращающего зубчатое колесо, входящее в пазы рейки с гребенчатой нарезкой.
СТРОЕНИЕ МИКРОСКОПА И ПРАВИЛА РАБОТЫ С НИМ
Микроскопический метод (гр. micros - мельчайший, scoрeo - смотрю) позволяет изучать структуру клетки с помощью микроскопов (светового, фазово-контрастного, люминесцентного, ультрафиолетового, электронного). При световой микроскопии объект рассматривается в лучах видимого света. Для этого используются микроскопы типа МБР, МБИ, МБС-1, Р-14, МИКМЕД - 1 и др.
Микроскоп состоит из механической, осветительной и оптической частей.
К механической части микроскопа относятся: подставка штатива (башмак), колонка штатива (тубусодержатель), тубус, предметный столик с клеммами или фиксаторами препарата, сортировочные винты (винты перемещения предметного столика и препарата), револьвер, макро- и микрометрические винты, винт конденсора, рычаг ирис-диафрагмы, оправа для светофильтров. Сортировочные винты применяются для центровки объекта на препарате. Револьвер состоит из двух сегментов шара, соединенных друг с другом центральным винтом. Верхний сегмент шара крепиться к тубусу. В нижнем сегменте имеются отверстия для вкручивания объективов. Макро- и микрометрические винты обеспечивают грубую и микрометрическую фокусировку (изменяют расстояние между объективом и изучаемым объектом).
Осветительная часть состоит из подвижного зеркала, ирисдиафрагмы, конденсора и светофильтров (матового и синего). Зеркало служит для улавливания света и направления его на препарат (объект). Зеркало имеет две поверхности - плоскую и вогнутую. Плоская поверхность зеркала используется при ярком освещении, вогнутая - при слабом. Диафрагма состоит из системы металлических пластин, которые за счет движения рычага могут сходиться к центру или расходиться. Диафрагма находится под конденсором и служит для изменения ширины светового пучка. Конденсор (система линз) концентрирует рассеянные лучи света в тонкий пучок параллельных лучей и направляет их на объект. Он передвигается специальным винтом вверх - вниз, что позволяет установить оптимальное освещение препарата. Обычное положение конденсора самое верхнее. Светофильтры устраняют дифракцию света. Они располагаются в специальной откидной оправе, находящейся под ирис-диафрагмой. Матовый светофильтр используется при рассеянном освещении, синей – при ярком свете.
Увеличительные приборы: микроскоп МБР–1 и микроскоп Р-14.
Механическая часть: 1 - подставка штатива (основание); 2 - колонка штатива (тубусодержатель); 3 - тубус; 4 - револьвер; 5 - предметный столик; 6 - сортировочные винты; 7 - макрометрический винт; 8 - микрометрический винт; 9 - винт конденсора;10 - рычаг ирис-диафрагмы, 11 - оправа для светофильтров.
Осветительная часть : 12 – зеркало; 13 - диафрагма; 14 – конденсор.
Оптическая часть: 15 - окуляр; 16 - объективы.
Оптическая часть состоит из объективов (система линз, обращенная к объекту), которые расположены в гнездах револьвера, и окуляров (система линз, обращенная к глазу исследователя). Окуляры вставляются в верхнее отверстие тубуса. Обычно, микроскопы комплектуются тремя объективами (8х - объектив малого увеличения, 40х - объектив большого увеличения, 90х - иммерсионный объектив). В соответствии с этим на объективе имеется маркировка 8, 40 или 90. На окулярах также имеется маркировка, указывающая кратность их увеличения. Чаще всего используют окуляры с увеличением 7, 10 и 15 раз.
Общее увеличение микроскопа (величина, показывающая во сколько раз линейные размеры изображения больше линейных размеров объекта) равно произведению увеличений окуляра и объектива. Например, при работе с окуляром 10х и объективом 8х происходит увеличение линейных размеров объекта в 80 раз (8 х 10 = 80).
Важнейшей характеристикой светового микроскопа является разрешающая способность. Разрешающая способность (d) - минимальное расстояние между двумя точками объекта, которые видны раздельно. Она определяется по формуле:
d = 0,61 _________________
где λ - длина волны света, n - показатель преломления среды между объектом и объективом, α - угол между оптической осью объектива и наиболее отклоненным лучом, попадающим в объектив. Величина «n sin α» называется числовой апертурой объектива. У объектива «8х» она равна 0,20; у объектива «40х» - 0,65; у объектива «90х» - 1,25. Предел разрешающей способности микроскопа зависит от длины волны источника света. У светового микроскопа она равна 555 нм. Поэтому современные оптические микроскопы имеют предел полезного увеличения до 1500 раз.
Правила работы с микроскопом на малом увеличении (объектив 8х).
1. Перед началом работы проверить исправность микроскопа, протереть линзы окуляра, объективов, конденсора и зеркало салфеткой. Развинчивать окуляры и объективы запрещено.
2. Микроскоп расположить на рабочем месте слева, на ширину ладони от края стола, тубусодержателем к себе и предметным столиком от себя.
3. Поднять конденсор и поставить его на уровне предметного стола, открыть диафрагму.
4. Движением револьвера довести до щелчка объектив малого увеличения «8х» (щелчок свидетельствует о том, что оптическая ось окуляра
и объектива совпадают).
5. Вращением макрометрического винта расположить объектив «8х» на 1 см от предметного столика.
6. Осветить поле зрения: глядя в окуляр, поворачивать зеркало большим и указательным пальцами одной или обеих кистей рук по отношению к источнику света до тех пор, пока всё поле зрения не будет освещено равномерно и достаточно интенсивно. Пальцы располагать на боковой поверхности зеркала так, чтобы ими не закрывать само зеркало. Микроскоп с этого момента нельзя перемещать на рабочем месте.
7. Взять препарат из гистологической коробки большим и указательным пальцами за боковые поверхности предметного стекла. Проверить, где лицевая сторона препарата (на лицевой стороне находится покровное стекло). Рассмотреть препарат на свет. Определить место нахождения объекта. Положить препарат на предметный столик микроскопа лицевой стороной вверх так, чтобы сам объект находился в центре отверстия предметного столика.
8. Глядя сбоку, с помощью макрометрического винта, опустить объектив малого увеличения на расстояние 0,5 см от препарата, т. е. ниже фокусного.
9. Глядя в окуляр, движением макрометрического винта на себя, плавно поднять тубус вверх до появления четкого изображения объекта.
10. С помощью сортировочных винтов или плавных движений пальцев руки объект, или интересующую нас часть объекта, вывести в центр поля зрения, после чего приступить к изучению препарата и зарисовке его в альбом.
11. По окончании изучения препарата макрометрическим винтом поднять объектив «8х» на 2 - 3 см. Препарат снять с предметного столика и положить в гистологическую коробку.
12. По окончании работы на предметный столик положить салфетку, объектив «8х» опустить вниз на расстояние 0,5 см от предметного столика. Микроскоп накрыть чехлом и поставить на место хранения. При переносе микроскопа необходимо одной рукой держать микроскоп за штатив, а другой поддерживать зеркало снизу.
Правила работы с микроскопом на большом увеличении (объектив 40х).
1. При работе с микроскопом на большом увеличении сначала необходимо выполнить все пункты правил работы с объективом «8х» (см. пункты 1 - 10).
2. После нахождения объекта на малом увеличении необходимо вывести интересующую нас часть точно в центр поля зрения с помощью сортировочных винтов (при переходе к большому увеличению диаметр фронтальной линзы объектива уменьшается в 5 раз, поэтому если не сделать центровку, объект может оказаться за пределами поля зрения).
3. Макрометрическим винтом поднять объектив вверх на 2 - 3 см и с помощью револьвера заменить объектив «8х» на объектив «40х».
4. Глядя сбоку, макрометрическим винтом опустить объектив «40х» так, чтобы расстояние между ним и препаратом составило 1 мм, т. е. объектив оказался ниже фокусного расстояния.
5. Глядя в окуляр, макрометрическим винтом плавно поднять тубус вверх до появления изображения объекта.
6. Дофокусировку провести с помощью микрометрического винта, который разрешается вращать вперед или назад не более чем на полоборота.
7. Изучить препарат. Зарисовать.
8. По окончании изучения препарата макрометрическим винтом объектив «40х» поднять вверх на 2-3 см. Препарат снять со столика и положить в гистологическую коробку. Поворотом револьвера заменить объектив «40х» на объектив «8х», на предметный столик положить салфетку.
С помощью макрометрического винта опустить объектив «8х» на расстояние 0,5 см. Микроскоп закрыть чехлом и поставить на место хранения.
Работа с иммерсионным объективом (объектив 90х).
Объектив «90х» применяется при работе с очень мелкими и тонкими объектами. Пространство между объективом и препаратом заполняется специальным иммерсионным маслом. Масло имеет показатель преломления, приближающийся к показателю преломления стекла, поэтому световые лучи попадают в объектив, не преломляясь и не изменяя направления при прохождении различных сред. Иммерсионный объектив требует осторожного обращения, так как его фронтальная линза имеет маленькое
фокусное расстояние и при грубой работе можно повредить и объектив, и препарат.
1. Прежде, чем приступить к работе с объективом «90х», необходимо найти объект при увеличении 56х, а затем 280х. Точно вывести интересующую часть объекта в центр поля зрения с помощью сортировочных винтов, т.к. необходимо помнить обратную зависимость между силой увеличения и диаметром фронтальной линзы.
2. Макрометрическим винтом поднять объектив «40х» вверх на 2 –3 см. На исследуемый участок препарата нанести стеклянной палочкой каплю иммерсионного масла. Капля не должна быть очень большой или очень малой. С помощью револьвера заменить объектив «40х» на объектив «90х».
3. Глядя сбоку, макрометрическим винтом опустить объектив «90х» в каплю масла почти до соприкосновения с покровным стеклом, т. е. ниже фокусного расстояния.
4. Глядя в окуляр, макрометрическим винтом плавно поднять объектив «90х» вверх до появления изображения.
5. Пользуясь микрометрическим винтом, добиться четкого изображения объекта; приступить к его изучению и зарисовке в альбом (при необходимости).
6. После окончания изучения препарата макрометрическим винтом поднять объектив «90х» вверх на 2-3 см над столиком. Препарат снять, стереть масло полоской фильтровальной бумаги и протереть салфеткой. Препарат положить в гистологическую коробку. Линзу объектива «90х» также протереть полоской фильтровальной бумаги, а затем салфеткой. В случае сильного загрязнения, когда масло засыхает, объектив рекомендуется протереть салфеткой, смоченной бензином.
7. С помощью револьвера заменить объектив «90х» на объектив «8х». На предметный столик положить салфетку. Макрометрическим винтом объектив «8х» опустить вниз на расстояние 0,5 см от предметного столика. Микроскоп закрыть чехлом и поставить на место постоянного хранения.
Подготовила: доцент Логишинец И.А.
Литература:
1. Бекиш О.-Я.Л., Никулин Ю.Т. Практикум по биологии (для студентов 1-го курса фармацевтического факультета).- Витебск, 1997.- 90с.
2. http://wikipedia.ru
