Методика заливки в желатин.

Метод пригоден для эмбриологических. исследований, заливки рыхлых тканей и органов (не вызывает сморщивания), при исследованиях с целью выявления жиров и ли­поидов. Режут желатиновый блок только на замораживающем микротоме.

Для заливки приготавливают два раствора:

а) 25% раствор: 25 г размельченной или порошкообразной желатины растворяют в водяной бане (при 37°) в 75 мл 1 % карболовой воды (во избежание испарения сосуд должен быть закрыт);

б) 12,5% раствор: 1 часть густого раствора разбавляют 1 частью теплой 1% карболовой воды. Для приготовления последней в 100 мл дистиллированной воды рас­творяют 1 г карболовой кислоты при постоянном взбалтывании.

Приготовленные растворы желатины разливают в от­дельные пробирки или другие небольшие сосуды порциями,

Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Для окраски цитоплазмы используют 1% водный раствор эозина.

Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллированную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депарафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повторного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следующий :

1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллированной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спиртах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно установить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окрашивать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими и в цитоплазме может быть синеватый фон.

ОКРАСКА ГЕМАТОКСИЛИНОМ — ЭОЗИНОМ

Окраска гематоксилин-эозином — наиболее распространённый метод окрашивания срезов. Этот методпозволяет установить отношения между частями органа, отлично выявляя все клеточные элементы и некоторые неклеточные структуры. Практически во всех случаях независимо от поставленной задачи применяется окраска гематоксилин-эозином. В большинстве случаев для изучения структуры нормального или измененного в результате болезни органа ограничиваются этим методом окраски. В других случаях, когда перед исследователем стоит специальная задача, пользуются особыми методами, окрашивая в то же время параллельно ряд срезов гематоксилин-эозином.

Эта окраска является двойной: гематоксилин — основной краситель — окрашивает ядра клеток, эозин — кислый краситель — красит протоплазму клеток и в меньшей степени — различные неклеточные структуры.

Гематоксилин представляет собой экстракт древесины кампешевого дерева, произрастающего в Америке. Эозин — искусственная краска. Растворы красителей должны быть приготовлены заранее. Гематоксилин сам по себе не является красящим веществом. Для того чтобы приготовить краску, гематоксилин подвергают окислению, в результате чего он превращается в красящее вещество — гематеин. В соединении с некоторыми солями гематеин дает четкое окрашивание ядер (используют гематоксилин Эрлиха, Майера, железный гематоксилин Гейденгайна).

Эозин — протоплазматический краситель; используется он в виде спиртовых или, гораздо чаще, водных растворов. Для приготовления эозина 0,1 г краски растворяют в 100 мл дистиллированной воды. Подготовка срезов к окраске заключается в их кратковременной обработке спиртом. Поскольку при заливке в парафин или целлоидин материал обезвоживается в спиртах, срезы, полученные при этих способах заливки, в особой подготовке для окраски гематоксилин-эозином не нуждаются. Обрабатывать необходимо замороженные срезы. При этом происходит их обезжиривание и другие изменения в структуре, что значительно улучшает окрашивание гематоксилин-эозином. Срезы обрабатывают в 96° спирте не более 3-5 минут. Из спирта срезы переносят обратно в дистиллированную воду. Окраску производят сначала гематоксилином.

Порядок проведения окраски:

Дистиллированная вода	ополоснуть
Раствор гематоксилина	1-20 мин
Солянокислый спирт	дифференцировка
Аммиачная вода	срезы синеют (контроль под микроскопом)
Проточная вода	5-10 мин
Дистиллированная вода	ополоснуть
Раствор эозина	10с-3 мин
Спирт 96%, карбол-ксилол, заключение

Результат: ядра синие, цитоплазма и межклеточное вещество розовые.

Примеры практических микропрепаратов, окрашенных гематоксилином-эозином:

Рис. 1, 2. Болезнь Фара (феррокальциноз). В веществе головного мозга из зоны подкорковых ядер зональное обызвествление (практически без признаков склероза) стенок небольших сосудов (капилляров, мелких артерий и артериол) различной степени выраженности (от пылевидного включения солей кальция в толще стенки до полного замещения сосудистых стенок кальцинатами). Вдоль стенок большинства капилляров густо расположены небольшие округло-овальные кальцинаты по типу псаммом, вокруг отдельных капилляров образованы целые муфты петрификатов.
Рис. 3, 4. Болезнь Фара (феррокальциноз, другое наблюдение). Крупные группы густо расположенных мелких сосудов с наличием циркулярного пылевидного и в виде мелких гранул кальциноза стенок, расположенного между адвентицией сосудов и средней их оболочкой, в толще средней оболочки, полностью замещающего сосудистую стенку. Видны фрагменты сосудистых стенок в косопоперечном, продольном срезе, утолщенные кальцифицированные стенки выглядят как «кусочки вермишели».
Рис. 5. Очаговый интрамуральный кардиосклероз. Сохранившиеся кардиомиоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, выраженной гипертрофии. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.			Рис. 6. Умеренная-выраженная гипертрофия кардиомиоцитов, белковая зернистая их дистрофия. В цитоплазме ряда кардиомиоцитов вокруг ядер расположены мелкие скопления золотисто-жёлтого «пигмента старения» липофусцина. Очаговая круглоклеточная инфильтрация стромы. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 7, 8. Грибковый перикардит (острый гнойно-фибринозный), группа гиалогифомикозов. Очаги выраженной лейкоцитарной инфильтрации с включениями относительно рыхлого фибрина на фоне очагово-диффузных диапедезно-деструктивных кровоизлияний расположены в эпикарде и субэпикардиальной жировой ткани. Здесь же расположены колонии грибковой микрофлоры, относящейся к гиалогифомикозам: хорошо окрашены гематоксилином-эозином, гифы в диаметре около 2-3 мкм, разрастаются пучками от центрального фокуса в виде «кустарника». Некоторые гифы дихотомично делятся. Мицелий септированный.
Рис. 9, 10. Метастазы плоскоклеточного рака в миокард, субэпикардиальную жировую ткань. Увеличение х250.
Рис. 11. Актиномикоз лёгкого с перифокальной картиной очаговой острой гнойной пневмонии. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100.				Рис. 12. Лёгочная миграция личинки аскариды. В просвете альвеолы червеобразная структура розового цвета, свёрнутая в клубок, с признаками её движения (тонкие перифокальные полоски просветления в реактивном гнойном экссудате). Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
				Рис. 13-15. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания древовидного мицелия с перифокальной острой гнойно-фибринозной пневмонией. В отдельных полях зрения видны спорангии со спорами. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250. Препараты предоставлены кафедрой судебной медицины Ижевской ГМА, Свердловским ОБСМЭ.
Рис. 16, 17. Грибковая (кандидозная) пневмония. Лёгочная ткань разрушена за счёт выраженного разрастания мицелия с большим количеством спороносцев. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100 и х250.
Рис. 18. Криптококкоз лёгкого. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х100.					Рис. 19. Криптококкоз печени. Окраска: гематоксилин и эозин. Увеличение х250.
Рис. 20, 21. Печень. Очаговое острое гнойное межуточное воспаление с преобладанием эозинофилов. Очаговое выраженное полнокровие синусоидных капилляров и центральных вен с эритростазами, диапедезными микрогеморрагиями. Гепатоциты в состоянии выраженной белковой зернистой дистрофии, мелко — и крупнокапельной жировой дистрофии. Часть печёночных клеток в состоянии некробиоза-некроза. Окраска: гематоксилин-эозин. Увеличение х250.
Рис. 22. Выраженная очаговая гидропическая дистрофия гепатоцитов, сочетающаяся с мелко — и крупнокапельной жировой дистрофией печёночных клеток. Окраска: гематоксилин-эозин.

Гистологический образец лёгочной ткани человека, окрашенный гематоксилин-эозином.

Окраска гематоксилином и эозином (окраска гематоксилин-эозином) - один из самых распространённых методов окраски в гистологии . Широко используется в медицинской диагностике, в частности в онкологии для окраски ткани, полученной при биопсии .

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителя эозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержат нуклеиновые кислоты (ДНК и РНК): клеточное ядро , рибосомы и РНК-богатые участки цитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточные белки , например, тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой. Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

Техника окраски гематоксилин-эозином

1. Удаляют парафин из срезов в орто-ксилоле или толуоле , проводят по спиртам нисходящей концентрации и доводят до воды (две порции ксилола или толуола – 3-5 минут, 96° этанол – 3 минуты, 80° этанол – 3 минуты, 70° этанол – 3 минуты, дистиллированная вода – 5 минут).
2. Окрашивают гематоксилином 7-10 минут (в зависимости от зрелости красителя).
3. Промывают в дистиллированной воде – 5 минут.
4. Дифференцируют в 1% соляной кислоты на 70° этаноле до побурения срезов.
5. Промывают дистиллированной водой, а затем слабым (0,5 %) раствором аммиака до посинения срезов.
6. Окрашивают водным раствором эозина 0,5-1 минуту (в зависимости от желаемой окраски).
7. Промывают в трех порциях дистиллированной воды для удаления избытка эозина.
8. Удаляют воду из срезов в одной порции 70° этанола, двух порциях 96° этанола. Экспозиция в каждой порции спирта – 2 минуты.
9. Просветляют срезы в двух порциях карбол-ксилола (смесь расплавленного фенола и ксилола либо толуола в соотношении 1:4 или 1:5) – 1 минута.
10. Производят окончательное обезвоживание срезов в двух порциях ксилола или толуола. Прибывание срезов 2 минуты.
11. Заключить срезы в канадский бальзам или синтетическую среду для заключения гистологических срезов.

Некоторые структуры плохо прокрашиваются гематоксилином и эозином (как правило гидрофобные) и требуют иных методов окраски. Например, участки клеток, богатые липидами и миелином, остаются неокрашенными: адипоциты , миелиновая оболочка аксонов нейронов , мембрана аппарата Гольджи и др.

См. также

Ссылки

• Rosen Lab, Department of Molecular and Cellular Biology, Baylor College of Medicine) Step by step protocol

Wikimedia Foundation . 2010 .

Смотреть что такое "Окраска гематоксилином и эозином" в других словарях:

Гистологический образец лёгочной ткани человека, окрашенный гематоксилин эозином. Окраска гематоксилин эозин (окраска гематоксилином и эозином) является одним из самых распространённых методов гистологии. Широко используется в медицинской… … Википедия

Туберкулез органов дыхания. Органы дыхания при туберкулезе (Туберкулёз органов дыхания) поражаются наиболее часто. В соответствии с принятой в нашей стране клинической классификацией туберкулеза различают следующие формы Т. о. д.: первичный… … Медицинская энциклопедия

I Сердце Сердце (лат. соr, греч. cardia) полый фиброзно мышечный орган, который, функционируя как насос, обеспечивает движение крови а системе кровообращения. Анатомия Сердце находится в переднем средостении (Средостение) в Перикарде между… … Медицинская энциклопедия

- (leucoscs; греч. leukos белый + ōsis; синоним лейкемия) заболевания опухолевой природы, протекающие с вытеснением нормальных ростков кроветворения: опухоль возникает из кроветворных клеток костного мозга. Заболеваемость Л. неодинакова в различных … Медицинская энциклопедия

I Пневмония (pneumonia; греч. pneumon легкое) инфекционное воспаление легочной ткани, поражающее все структуры легких с обязательным вовлечением альвеол. Неинфекционные воспалительные процессы в легочной ткани, возникающие под влиянием вредных… … Медицинская энциклопедия

Туберкулез внелегочный условное понятие, объединяющее формы туберкулеза любой локализации, кроме легких и других органов дыхания. В соответствии с клинической классификацией туберкулеза (Туберкулёз), принятой в нашей стране, к Т. в. относят… … Медицинская энциклопедия

I Плацента (лат. placenta лепешка; синоним детское место) развивающийся в полости матки во время беременности орган, осуществляющий связь между организмом матери и плодом. В плаценте происходят сложные биологические процессы, обеспечивающие… … Медицинская энциклопедия

I Забрюшинное пространство (spatium retroperitoneale; синоним ретроперитонеальное пространство) клетчаточное пространство, расположенное между задней частью париетальной брюшины и внутрибрюшной фасцией; простирается от диафрагмы до малого таза. В … Медицинская энциклопедия

I Матка Матка (uterus, metra) непарный мышечный полый орган, в котором происходят имплантация и развитие зародыша; расположен в полости малого таза женщины. Органогенез Развитие М. во внутриутробном периоде начинается при длине плода около 65 мм … Медицинская энциклопедия

I Мокрота (sputum) выделяемый при отхаркивании патологически измененный трахеобронхиальный секрет с примесью слюны и секрета слизистой оболочки носа и придаточных (околоносовых) пазух. В норме трахеобронхиальный секрет состоит из слизи,… … Медицинская энциклопедия

Эта окраска является двойной: гематоксилин - основной краситель - окрашивает ядра клеток, эозин - кислый краситель - красит протоплазму клеток и в меньшей степени - различные неклеточные структуры.

Окраска включает использование основного красителя гематоксилина , окрашивающего базофильные клеточные структуры ярко-синим цветом, и спиртового кислого красителяэозина Y , окрашивающего эозинофильные структуры клетки красно-розовым цветом. Базофильные структуры, как правило, это те, которые содержатнуклеиновые кислоты (ДНК иРНК ):клеточное ядро ,рибосомы и РНК-богатые участкицитоплазмы . Эозинофильные структуры содержат внутри- и внеклеточныебелки , например,тельца Леви . Цитоплазма является эозинофильной средой.Эритроциты всегда прокрашиваются ярко-красным цветом.

2. Окраска железным гематоксилином

Краситель для микроскопических препаратов. Обеспечивает визуализацию ядер клеток в срезах (парафиновых, криостатных, вибрoтомных, изготовленных на заморажи-вающем микротоме) и цитологических препаратах. Реагент не содержит этанола и метанола. Предназначен для использования в качестве ядерного красителя при окраске соединительной ткани по Ван-Гизону, Маллори, Массону и в других многоцветных методах окраски гистологических препаратов. Достоинствами предлагаемого гематоксилина являются отличное и интенсивное окрашивание ядер клеток в срезах, устойчивость окраски к пикриновой Кислоте и другим слабым кислотам, отсутствие тенденции к перекраске препарата(при соблюдении рекомендаций) и необходимости дифференцировки окраски.

3. Окраска метиленовым синим Лефлера Методика окраски. Смешивают 30 мл насыщенного спиртового раствора метиленового синего со 100 мл 0,01 % раствора гидроксида калия. Мазки окрашивают в течение 3 - 5 мин, ополаскивают в проточной воде, дифференцируют 3 сек в 0,5 % растворе уксусной кислоты и ополаскивают в проточной воде. Проводят через спирты, просветляют в ксилоле и заключают в бальзам. Препараты можно изучать при масляной иммерсии без заключения в бальзам, но в этом случае они хранятся недолго. Результат: бактерии окрашиваются в густо-синий цвет.

Органический основной тиазиновый краситель , применяют для окраскихлопка ,шерсти ,шелка в ярко-голубой цвет, однако окраска слабоустойчива на свету. Ваналитической химии применяется для определенияхлоратов ,перхлоратов ,катионов ртути ,олова ,магния ,кальция ,кобальта ,кадмия .

В медицине используется в качествеантисептика ,антидот при отравлениицианидами ,угарным газом исероводородом . Имеются сообщения о высокой эффективности этого соединения при леченииболезни Альцгеймера .

4. Окраска пикрофуксином

При окраске пикрофуксином набухшие коллагеновые пучки ярко-красного цвета, гомогенные с плохо различимым волокнистым строением. В очагах более резкого поражения коллагеновые пучки неравномерной окраски, местами они ярко-красные, местами с пятнами желтого цвета, местами коричневые. 5. Окраска по Романовскому-Гимзе Приготовление красителя Готовый жидкий краситель перед окрашиванием мазков разводят из расчета 1-2 капли красителя на 1 мл дистиллированной воды. Мазки окрашивают 20 - 25 минут при 370 C во влажной камере (закрытая чашка Петри с увлажнённым фильтром на дне). После окрашивания мазки промывают в проточной воде, сушат на воздухе и исследуют при масляной иммерсии. Красящую смесь Романовского-Гимзы в виде порошка (коммерческий краситель) растворяют в смеси равных объемов метилового спирта и глицерина (800 мг красителя на 100 мл растворителя). Краситель растворяется плохо, поэтому лучше его растереть с растворителем в количестве 300 мг на 100 мл, а затем, помешивая, добавлять краситель до получения нужной концентрации. Приготовление красителя часто занимает несколько дней. Важно в качестве растворителей использовать химически чистый метиловый спирт и глицерин, так как примеси ухудшают свойства красителя. Вместо метилового спирта можно применять 100 % этиловый спирт. Приготовленную красящую смесь хранят в сухом прохладном месте в плотно закрытом сосуде. Методика окраски 1. Мазки, фиксированные в метиловом спирте, окрашивают раствором (1 мл готовой жидкой краски + 2 мл основного буферного раствора + 47 мл дистиллированной воды) в течение 40-120 мин (продолжительность окрашивания подбирают эмпирически). Пользуются фосфатным буфером, но рН буфера зависит от вида мазка: для мазка костного мозга - 5,8 - 6,0, для мазка крови - 6,4 - 6,5, для выявления простейших - 6,8, малярийного плазмодия - 7,0 - 7,2. 2. Ополаскивают в дистиллированной воде, высушивают и исследуют при иммерсии. Результат: бактерии окрашиваются в фиолетово-красный цвет, цитоплазма клеток - в голубой, ядра - в красный.

6. Окрашивание конго-красным

Внешний вид - красно-коричневые кристаллы. плохо растворим в холодной воде. В органических растворителях не растворяется.Данный краситель находит применение в микроскопических исследованиях и используется, в виде спиртового, водного или аммиачного раствора для окрашивания клеточной оболочкигрибов (самостоятельно, либо в сочетании сгенциановым фиолетовым ) . Конго красный широко применяется в гистологии для выявления амилоида . Помимо этого "классического" применения, конго красный используется в десятках других процедур окрашивания в зоологии беспозвоночных, ботанических исследованиях, цитологии человека и животных .

1. Депарафинировать в ксилоле - 2 мин.

2. Удалить ксилол 96° спиртом - 2 мин. Затем стекло со срезами поместить в дистиллированную воду - 2 мин (можно дольше).

3. Окрашивание: на срез нанести каплю раствора гематоксилина на 2-З мин.

4. Срез поместить в водопроводную воду на 5- 10 мин (можно на сутки, тогда гематоксилин лучше "вызреет" и окраска будет лучше).

5. Срез ополоснуть дистиллированной водой и нанести каплю раствора эозина - 1 мин.

6. Сполоснуть в 2-3 порциях дистиллированной воды по 0,5-1 мин в каждой.

7. Обезводить в двух порциях 96° спирта по 1 мин в каждом (лучше капать из капельницы).

8. Окончательно обезводить в 100° спирте или карбол-ксилоле – 1 мин.

9. Просветлить срез ксилолом - 2 мин.

10.Заключить срез в бальзам и покрыть покровным стеклом.

После этого препарат подсушивают, чтобы бальзам затвердел. Хранят препараты в защищенном от света месте.

Методика окрашивания гематоксилином
и эозином целлоидиновых срезов

1. Окрасить в гематоксилине в течение 2-3 мин.

2. Промыть сначала в водопроводной, а затем в дистиллированной воде по 2-5 мин.

3. Окрасить в эозине в течение 1-2 мин.

4. Промыть в дистиллированной воде в течение 0,5-1 мин.

5. Обезводить в спиртах восходящей концентрации (70 %, 96 %, 100 %) по 1-2 мин.

6. Просветлить в карбол-ксилоле и ксилоле по 2-3 мин.

7. Заключить окрашенные срезы в бальзам.

Окрашивание срезов для обзорных целей

Различают методы окраски для обзорных целей, применяемые для получения общего представления о морфологии ткани или органа, и специальные, предназначенные для выявления определенных элементов клетки или ткани (например, комплекса Гольджи, митохондрий, эластических волокон соединительной ткани и т.д.). Ниже рассматриваются лишь некоторые методы окрашивания для обзорных целей. Суть их обычно заключается в том, что при этом окрашиваются ядра и каким-то контрастным красителем – цитоплазма.

Ядерные (основные) красители. Для окрашивания ядер используются гематоксилин, кармин, сафранин и другие основные красители. Существует несколько способов приготовления растворов гематоксилина. Наиболее распространенным является гематоксилин Эрлиха.

Гематоксилин Эрлиха. Для его приготовления 2,0 г гематоксилина растворяют в 100 мл 96% спирта и к полученному раствору добавляют 100 мл дистиллированной воды, 100 мл глицерина, 3,0 г калийных квасцов и 10 мл ледяной уксусной кислоты. Все ингредиенты нужно добавлять в указанной последовательности. Полученный раствор необходимо поставить на свету и при доступе воздуха не менее чем на 15 дней с тем, чтобы гематоксилин успел окислиться в гематеин, который и является красящим веществом. Банку с раствором при этом накрывают бумажным колпачком или сложенной в несколько раз марлей. Гематоксилин Эрлиха окрашивает ядра в синий цвет. Его используют при окрашивании срезов гематоксилин-эозином (см. ниже).

Железный гематоксилин Гейденгайна окрашивает в черный цвет не только ядра, но и митохондрии, темные диски скелетной и сердечной мышечной ткани и другие структуры. Для его приготовления 1 г гематоксилина растворяют в 10 мл 96% спирта, добавляют 90 мл дистиллированной воды и оставляют созревать на срок не менее 4 недель. Перед окрашиванием срезы протравливают в течение 2-12 ч в 2,5% растворе железоаммиачных квасцов. Раствор квасцов получают за счет 4-кратного разведения исходного 10% раствора, для приготовления которого используются кри­сталлы квасцов только фиолетового цвета. После промывания в дистиллированной воде срезы окрашивают в течение 1-36 ч раство­ром гематоксилина, разведенным вдвое по сравнению с исходным. В зависимости от исследуемого материала можно использовать и большие разведения красителя. Окрашенный срез ополаскивают дистиллированной водой и дифференцируют под контролем микроскопа в растворе железоаммиачных квасцов. После этого срезы промывают в водопроводной воде не менее 30 мин при частой смене воды.

Железный гематоксилин Вейгерта готовят в виде двух основных растворов - раствора Вейгерта I и раствора Вейгерта II. Раствор Вейгерта I представляет собой 1% раствор

гематоксилина в 90% спирте (1 г гематоксилина на 100 мл спирта). Раствор Вейгерта II имеет следующий состав: официнальный раствор полуторахлористого железа 4 мл, 1 мл концентрированной хлористоводородной кислоты (плотность 1,15-1,19) и 95 мл дистиллированной воды. Официнальный раствор полуторахлористого железа – это 50% раствор водного хлорного железа (FеСl 3 , 6Н 2 0). Перед употреблением смешивают равные объемы основных растворов. Основные растворы хранятся 3-4 мес. Смешанный раствор можно применять лишь несколько дней. Время окрашивания 1-5 мин. Затем следует промывка водопроводной водой. Срезы можно дифференцировать 0,1% раствором хлористоводородной кислоты в 70% спирте, после чего их тщательно промывают водопроводной водой. Железный гематоксилин Вейгерта должен окрашивать ядра в черный цвет. Если они приобретают коричневый цвет, то это свидетельствует о порче красителя.

Квасцовый карминприготовляют, растворяя 3-5 г аммиачных квасцов в 100 мл дистиллированной воды при нагревании, и добавляют 1 г кармина. Раствор кипятят 15 мин, охлаждают, фильтруют и добавляют 1 мл формалина. Время окрашивания – 0,5-24 ч, дифференцировка в дистиллированной воде проводится до прекращения отдачи красителя. Ядра окрашиваются в ярко-красный цвет. Окраску кармином можно проводить после импрегнации серебром или при выявлении железа.

Сафранин является прекрасным ядерным красителем, осо­бенно для материала, фиксированного в растворах, содержащих осмий или хром. 10 г чистого сафранина или сафранина «С-ехtrа» (качество красителя имеет очень большое значение) растворяют в смеси 155 мл 96% спирта со 145 мл дистиллированной воды. Из полученного таким образом основного раствора перед употреблением берут 20 мл и добавляют 80 мл 50% спирта. Время окрашивания 24 ч. После ополаскивания в дистиллированной воде срезы дифференцируют, контролируя под микроскопом в 0,1% растворе хлористоводородной кислоты в абсолютном спирте. Затем следует промывка абсолютным спиртом, просветление в ксилоле, заключение в бальзам.

Кислые красители. Эти красители не являются избирательно цитоплазматическими. Красители для цитоплазмы подбирают таким образом, чтобы их цвет хорошо контрастировал с окраской ядер. Для докрашивания цитоплазмы после окраски ядер гематоксилином чаще всего используется 1% водный раствор эозина. Для срезов, окрашенных кармином, используют раствор пикриновой кислоты, полученный путем разведения водой насыщенного раствора пикриновой кислоты в отношении 1:3 (при комнатной температуре в 100 мл воды растворяется примерно 1,2 г пикриновой кислоты, следовательно, для получения насыщенного раствора следует взять чуть больше этого количества пикриновой кислоты). Время окра­шивания 2-5 мин. Цитоплазма клеток и эритроциты красятся в желтый цвет.

Методика окрашивания срезов гематокси­лин-эозином. Эта методика наиболее часто применяется и поэтому должна быть описана более детально. Этим методом можно окрашивать целлоидиновые срезы, депарафинированные, парафиновые или замороженные срезы. Замороженные срезы перед окрашиванием следует обезжирить, поместив их на 20-30 мин или на ночь в 96% спирт. Далее срезы переносят в дистиллиро­ванную воду. Целлоидиновые срезы переносят из одного бюкса в другой с помощью препаровальной иглы с загнутым концом. Депа­рафинированные и замороженные срезы можно окрашивать на предметном стекле, наливая или сливая соответствующие растворы. Растворы красителей при этом можно сливать обратно для повтор­ного использования.

Порядок окрашивания срезов гематоксилин-эозином следу­ющий: 1) срезы переносят в дистиллированную воду;

2) окрашивают гематоксилином Эрлиха 2-5 мин;

3) промывают в дистиллирован­ной воде;

4) затем промывают в водопроводной воде 3-5 мин;

5) осуществляют контроль под микроскопом;

6) дифференцируют 1% раствором хлористоводородной кислоты в 70° спирте 1-2 с;

7) быстро переносят срезы в водопроводную воду на 30 мин при частой смене; в водопроводной воде вишневая окраска ядер сменяется синей;

8) осуществляют контроль под микроскопом; если хроматин и ядрышко видны недостаточно четко, то дифференцировку следует повторить (срезы можно смотреть под большим увеличением, накрыв их покровным стеклом);

9) промывают в дистиллированной воде;

10) 1% водный раствор эозина 0,5-1 мин;

11) промывают в дистиллированной воде (и дифференцируют, так как вода смывает эозин); время промывки контролируют по цвету среза;

12) проводят обезвоживание, осветляют в ксилоле, заключают в бальзам. В спир­тах эозин также отмывается, так что проводить срезы по спиртам следует быстро. Время окрашивания в гематоксилине нужно устано­вить на первых 2-3 срезах и затем все срезы данного блока окраши­вать одинаково. Дифференцировку в растворе хлористоводородной кислоты в спирте можно не проводить, но в этом случае структуры ядра будут менее четкими, и в цитоплазме может быть синеватый фон.

Методика окрашивания азур-2-эозином. Эта методика также вполне пригодна для обзорных целей. Прогрессив­ный метод окрашивания азур-2-эозином довольно ненадежен, но регрессивный дает стабильные результаты. Основными растворами являются 0,1% водный раствор азура и 0,1% водный раствор эозина. Для приготовления рабочего раствора на 100 мл дистиллированной воды добавляют 100 капель основного раствора азура и 100-120 капель раствора эозина. Срезы помещают в раствор красителя на 12-24 ч. Затем срезы дифференцируют. Методы дифференцировки могут быть разными в зависимости от того, насколько интен­сивно окрасились срезы. Дифференцировку можно проводить в подкисленной дистиллированной воде, затем промывать в чистой дистиллированной воде, обезвоживать в спиртах, просветлять в кси­лоле и заключать в бальзам. При этом следует учесть, что в спиртах дифференцировка продолжается. Можно дифференцировать срезы прямо в 96% спирте. Ход дифференцировки контролируют под микроскопом. Окрасив несколько срезов, можно контролировать на глаз по цвету среза, время от времени выборочно проверяя качество окраски под микроскопом.

Методика окрашивания железным гематоксилин-пикрофуксином по Ван-Гизону. Срез окра­шивают железным гематоксилином Вейгерта в течение 2-5 мин. Вместо гематоксилина Вейгерта можно использовать гематоксилин Эрлиха. Дифференцировки не требуется, так как срезы дифферен­цируются в пикрофуксине. Для приготовления раствора пикрофуксина к 100 мл насыщенного водного раствора пикриновой кислоты добавляют 10 мл 1% водного раствора кислого фуксина. Раствор пикрофуксина хранится длительное время. После окрашивания железным гематоксилином срезы ополаскивают в дистиллирован­ной воде и переносят в пикрофуксин на 3-5 мин. Затем промывают дистиллированной водой, обезвоживают в спиртах, начиная с 96%, проводят через ксилол и заключают в бальзам. В воде смывают фуксин. Если пропустить промывку в воде – обсушить срез филь­тровальной бумагой, что иногда делают, мышечная ткань может быть окрашена в розовый цвет, а не в желтый, как полагается. Если промывать в воде слишком долго, фуксин смывается полностью. Пикриновая кислота смывается в спирте, поэтому обезвоживать нужно быстро. В результате окрашивания ядра клеток должны быть темно-коричневыми (или темно-фиолетовыми при окрашива­нии гематоксилином Эрлиха), коллагеновые волокна – красными, мышечная ткань, цитоплазма различных клеток и эритроциты – желтыми.

Вопросы для самопроверки

1. Определение гистологии как науки.
2. Объекты исследования гистологии.
3. Перечислите основные свойства микроскопического препарата.
4. Назовите основные этапы изготовления гистологического препарата.
5. Какие группы красителей используют в гистологической практике?
6. Чем отличаются временные гистологические препараты от постоянных?
7. Объясните принцип работы на микротоме?
8. Техника приготовления тотальных препаратов.
9. Какие методы исследования применяют в цитологии и гистологии?
10. Типы микроскопов.
11. Сходства и различия в световой и электронной микроскопии? Разрешающая способность и увеличение.
12. Правила пользования и устройство светового биологического микроскопа.
13. Правила оформления лабораторной работы.
14. Техника приготовления гистологического препарата – окраска гематоксилин и эозином.
15. Дайте характеристику и классификацию фиксаторам.
16. Назовите наиболее употребительные фиксаторы.
17. Назовите оптимальную толщину срезов при использовании заливки в парафин.
18. Преимущества и недостатки четырёх способов уплотнения материала: заливка в парафин, заливка в целлоидин, заливка в желатину; замораживание.
19. Для каких исследований применяют заливку в поливакс (карбовакс). Сущность этого метода.
20. Различные методы окраски гистологических срезов.
21. Методы окрашивания для обзорных целей.