Реакция связывания комплемента (РСК) и реакция длительного связывания комплемента (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РСК) И РЕАКЦИЯ ДЛИТЕЛЬНОГО СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА (РДСК)

РЕАКЦИЯ СВЯЗЫВАНИЯ КОМПЛЕМЕНТА, РСК, реакция Борде - Жангу [по имени бактериологов Ж. Борде (J. Bordet) и О. Жангу (О. Gengou), 1901], высокоспецифичная и очень чувствительная серологич. реакция, основанная на свойстве комплекса антиген - антитело фиксировать свободный комплемент.

Комплемент (система комплемента) (от лат.complementum - дополнение), группа глобулярных белков сыворотки крови животных и человека, представляющих собой часть иммунной системы организма. При попадании в организм инфицирующих его бактерий или вирусов, некоторых токсинов или возникновении собственных трансформированных клеток происходит активация комплемента, в результате чего клетки-мишени лизируются (разрушаются), а токсины и вирусы нейтрализуются. Поэтому систему комплементов рассматривают наряду с макрофагами как передовой рубеж иммунной защиты организма.

Эту реакцию широко применяют при идентификации антигенов и в серодиагностике инфекций, особенно заболеваний, вызванных спирохетами (реакция Вассермана), риккетсиями и вирусами.

РСК - сложная серологическая реакция. В ней участвуют комплемент и две системы антиген - антитело. По существу, это две серологические реакции.

Первая система - основная состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). К ней добавляют определенное количество комплемента. При соответствии антигена и антитела этой системы они соединятся и свяжут комплемент. Образовавшийся комплекс мелкодисперсный и не виден.

связывание комплемент реакция серодиагностика

Об образовании этого комплекса узнают с помощью второй системы гемолитической или индикаторной. В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело), т.е. готовый иммунный комплекс. В этой системе лизис эритроцитов может произойти только в присутствии комплемента. Если комплемент связан первой системой (при соответствии в ней антигена и антитела), то во второй системе гемолиза не будет - так как нет свободного комплемента. Отсутствие гемолиза (содержимое пробирки мутное или на дне ее Осадок эритроцитов) регистрируют как положительный результат РСК.

Если в первой системе антиген не соответствует антителу, то иммунный комплекс не образуется и комплемент останется свободным. Оставшийся свободным, комплемент участвует во второй системе, вызывая гемолиз, - результат РСК отрицательный (содержимое пробирок прозрачно - "лаковая кровь").

Компоненты реакции связывания комплемента:

1. Антиген - обычно лизат, экстракт, гаптен; реже взвесь микроорганизмов

2. Антитело - сыворотка больного

3. Комплемент - сыворотка морских свинок

4. Антиген - эритроциты барана Гемолитическая система

5. Антитело - гемолизин к эритроцитам барана

6. Изотонический раствор

Подготовка ингредиентов

1. Сыворотку разводят в 3 раза меньше ее титра. Готовят общее разведение сыворотки для всего опыта, объем которого определяют, умножив объем сыворотки в одной пробирке (например, 0,5 мл) на число пробирок, немного превышающее число их в опыте. Избыток жидкости необходим при приготовлении всех компонентов реакции: часть ее остается на стенках пробирок, колб, пипеток. Объемы разведенного гемолизина и взвеси эритроцитов, приливая сыворотку к эритроцитам, тщательно перемешивают и инкубируют 30 мин при 37°С (сенсибилизируют).

2. Эритроциты барана. Готовят 3% взвесь отмытых эритроцитов барана на все количество пробирок в опыте. Для приготовления гемолитической системы за 30 мин до внесения ее в опыт смешивают равные объемы эритроцитов барана с антителом к ним.

3. Комплемент обычно разводят 1: 10. Перед каждым опытом его обязательно титруют. Титр комплемента - это его наименьшее количество, при добавлении которого к гемолитической системе происходит полный гемолиз в течение 1 ч при 37°С.

4. Антиген обычно получают готовым с указанием его титра, т.е. того количества, которое после разведения антигена должно содержаться в 1 мл. Например, при титре 0,4 его разводят в 0,96 мл изотонического раствора. В опыт берут количество антигена, равное половине титра (0,5 мл). Это его рабочая доза. Готовят общее разведение антигена для всего опыта, умножая 0,5 мл на число пробирок в опыте.

5. Антитело - сыворотка больного. Свежую сыворотку перед опытом инактивируют, чтобы разрушить имеющийся в ней комплемент. Для этого ее прогревают 30 мин при 56°С на водяной бане или в инактиваторе с терморегулятором. Последний способ предпочтительнее: он исключает возможность перегрева

Постановка реакции связывания комплемента (РСК).

Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента).

Испытуемые сыворотки исследуют в разведении 1: 5 и 1: 10 (доза сыворотки 0,04 куб. см и 0,02 куб. см со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном (на специфичность) и без антигена (на антикомплементарность).

Испытуемые и контрольные сыворотки инактивируют в день постановки реакции в разведенном виде при 56-65°С (в зависимости от вида животных) в течение 30 мин. (также в РДСК).

Оба этапа реакции проводят в водяной бане при 37-38°С, бактериолитическую систему выдерживают 60 мин, второй этап реакции (с гемолитической системой) - 20 мин.

Контроли главного опыта РСК:

позитивная сыворотка в разведении 1: 5 без антигена и с контрольным антигеном; в разведениях от 1: 5 до ее титра со специфическим антигеном;

негативная сыворотка в разведениях 1: 5 и 1: 10 со специфическим антигеном, в разведении 1: 5 с контрольным антигеном и без антигена - антигены специфический и контрольный в двойной дозе - на антикомплементарность (комплемент +) и на гемотоксичность (комплемент);

гемолитическая система на гемотоксичность (комплемент).

Учет результатов. В контролях не должно быть даже следов гемолиза, так как в одном из них нет комплемента, в другом - гемолизина. Контроли свидетельствуют об отсутствии у компонентов реакции гемотоксичности (способности спонтанно лизировать эритроциты).

В опыте активность комплемента может снизиться за счет неспецифической адсорбции его другими компонентами реакции, поэтому для опыта количество комплемента увеличивают: берут следующую за титром дозу. Это - рабочая доза.

Существуют различные варианты постановки РСК: классич. метод постановки в виде макро - и микровариантов, реакция длительного связывания комплемента (РДСК) на холоде, метод количеств. РСК по 50 % -ному гемолизу сенсибилизированных эритроцитов и др. Для диагностики ряда заболеваний применяют более чувствительный метод - РДСК.

Постановка реакции длительного связывания комплемента (РДСК).

Первую фазу реакции проводят в холодильнике при 2-6°С в течение 16-18 час., вторую фазу в водяной бане 20 мин при 37-38°С.

Комплемент применяют в рабочем разведении 1: 25 или 1: 30 (при определении его рабочего разведения).

В первый день разливают сыворотки и антиген для главного опыта. Реакцию ставят в объеме 1 куб. см (по 0,2 куб. см каждого компонента). Контроли РДСК такие же как при постановке РСК.

Затем во все пробирки главного опыта и соответствующих контролей разливают комплемент по 0,2 куб. см в зависимости от его рабочего разведения, пробирки встряхивают и помещают в холодильник на 16-18 час. при 2-6°С.

На следующий день штативы с первой фазой вынимают из холодильника и после выдерживания в течение 20-30 мин. при комнатной температуре во все пробирки разливают гемолитическую систему в дозе (в приведенном примере - 0,6 куб. см). Штативы встряхивают и помещают в водяную баню на 20 мин. при 37-38°С.

Схема главного опыта РДСК представлена в таблице 3.

Учет результатов РСК, РДСК проводят дважды: первый раз - сразу после водяной бани, второй - после оседания эритроцитов на дно пробирки (через 3-4 часа после водяной бани) или на следующий день при хранении в холодильнике от 2° до 6°С.

Для объективного определения результатов реакции оценку рекомендуется проводить в процентах гемолиза. Для этого из реакции выбирают 5 пробирок с полным (100%) гемолизом и жидкость из них сливают в одну пробирку. Из нее готовят разведения с меньшим процентом гемолиза так называемую "Стандартную " шкалу.

Степень гемолиза в пробирках с исследуемыми сыворотками определяют путем сравнения со степенью гемолиза в "стандартных" пробирках и процент гемолиза выражают в крестах.

Степень задержки обратно пропорциональна проценту гемолиза эритроцитов:

++++ (4 креста) - отсутствие гемолиза, надосадочная жидкость прозрачная, бесцветная;

+++ (3 креста) - гемолиз 25 % эритроцитов;

++ (2 креста) - гемолиз 50% эритроцитов;

+ (1 крест) - гемолиз 75% эритроцитов;

(минус) - полный гемолиз эритроцитов, осадок отсутствует, жидкость интенсивно окрашена гемоглобином.

Оценка результатов РСК, РДСК.

Оценивают испытуемые сыворотки в разведениях 1: 5 и 1: 10 (0,04 куб. см, 0,02 куб. см) при полном гемолизе эритроцитов в контроле сыворотки без антигена и с контрольным антигеном.

Положительной оценивают реакцию при задержке гемолиза эритроцитов на 3-4 креста в разведении 1: 10.

Сомнительной - при задержке гемолиза эритроцитов на 1 крест в разведении сыворотки 1: 10 и от 2 до 4 крестов в разведении 1: 5.

Отрицательной - при полном гемолизе эритроцитов в разведениях сыворотки 1: 5и 1: 10.

Реакция гемолиза.

Реакция гемолиза (РГ) – это разрушение эритроцитов при действии антител при участии комплемента.

Компоненты РГ.

1. Антиген - 3% взвесь эритроцитов на изотоническом растворе хлорида натрия;

2. Антитело - гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам (гемолизины); сыворотку получают путем иммунизации кроликов эритроцитами барана;

3. Комплемент – система белков крови, которые адсорбируюся на комплексе антиген-антитело и формируют мембраноатакующий комплекс, который разрушает антиген, т.е. разрушает эритроциты или, по-другому, вызывает лизис эритроцитов (гемолиз ). В качестве комплемента используется свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок.

Если в пробирку поместить в определенных количествах эритроциты, гемолитическую сыворотку и комплемент, то в течение нескольких минут произойдет разрушение (гемолиз) эритроцитов, в результате чего смесь из темно-красной станет розовой ("лаковая кровь").

Реакция гемолиза используется в качестве индикатора при постановке реакции связывания комплемента.

Реакция связывания комплемента (РСК)– это сложная серологическая реакция, в которой участвуют 2 системы антиген-антитело и комплемент. 1-ая система – специфическая , 2-ая – гемолитическая система.

Эта реакция разработана Ж.Борде и О.Жангу, которые установили, что при образовании комплекса антиген-антител с этим комплексом связывается комплемент. Видимого эффекта при этом не наблюдается , поэтому для выявления связывания комплемента (а следовательно, и для выявления образования комплекса антиген-антитело при их соответствии друг другу), т.е. в качестве индикатора используется 2-ая – гемолитическая система.

РСК используется чаще для серодиагностики (обнаружения антител к возбудителю заболевания в сыворотке крови больного) гонореи, сифилиса, коклюша, сыпного тифа и др. риккетсиозов и многих вирусных заболеваний. РСК также используется для сероидентификации.

Компоненты РСК.

1. Антиген – экстракты микробов, гаптены, реже – взвесь микробов, т.е. антиген может быть как корпускулярным (нерастворимым), так и молекулярным (растворимым).

2 . Антитело – сыворотка крови больного человека (при серодиагностике) или иммунная диагностическая сыворотка, содержащая известные антитела (при сероидентификации).

3. Эритроциты барана – антигены гемолитической реакции.

4. Гемолитическая сыворотка – сыворотка, содержащая антитела к эритроцитам барана. Сыворотку получают путем иммунизации кролика эритроцитами барана.

5. Комплемент – свежеприготовленная сыворотка крови морских свинок (жидкая или лиофильно высушенная).

6. Электролит – изотонический раствор хлорида натрия.

Постановка РСК.

Перед постановкой опыта антиген, сыворотка больного, гемолитическая сыворотка и комплемент титруются (определяется их титр). Сыворотка больного прогревается при 56°С в течение 30 мин.

РСК проводят в 2 фазы .

I фаза – специфическая : в одной пробирке готовят специфическую систему - смешивают равные количества известного антигена, сыворотки больного и комплемента, в другой пробирке готовят гемолитическую систему – смесь эритроцитов барана и гемолитической сыворотки, пробирки ставят в термостат при 37°С на 30 мин. Одновременно готовят контроли на антиген, комплемент и гемосистему, контрольные пробы с сывороткой заведомо больного человека (положительная сыворотка) и заведомо здорового человека (отрицательная сыворотка) и также помещают в термостат на 30 мин.

II фаза – индикаторная : в исходную смесь и во все контрольные пробирки добавляют одинаковые количества гемолитической системы и учитывают результаты реакции после выдерживания в термостате 30 мин.

Учет результатов РСК проводятпри безупречных результатах в контролях.

Положительная реакция (человек болен и в его сыворотке имеются соответствующие антитела к возбудителю заболевания - антигену): в I фазе в специфической системе образуются комплексы антиген-антитело, с которыми связывается комплемент, после добавления гемолитической системы во II фазе гемолиз не наблюдается, так как комплемент связан 1-ой специфической системой. Видимый эффект – образование осадка эритроцитов.

Отрицательная реакция (человек здоров и в его сыворотке нет антител к возбудителю заболевания): комплексов антиген-антитело не образуется и комплемент в I фазе остается свободным, после добавления гемолитической системы во II фазе комплемент связывается с обязательно имеющимися здесь комплексами антиген-антитело (это комплексы эритроциты-антиэритроцитарные антитела) и вызывает гемолиз эритроцитов. Видимый эффект – гемолиз эритроцитов – "лаковая кровь".

В диагностике инфекционных заболеваний также используютсяреакция нейтрализация (РН) токсина антитоксической сывороткой , реакция иммунофлюоресценции (РИФ), радиоиммунный анализ (РИА), иммуноферментный анализ (ИФА).

Реакцию связывания комплемента (РСК) используют для выявления антител на определенный антиген или определяют тип антигена по известному антителу. Это сложная серологическая реакция, в ней участвуют две системы и комплемент. Первая система – бактериологическая (основная), состоит из антигена и антитела (один известный, другой нет). Вторая система – гемолитическая (индикаторная). В нее входят эритроциты барана (антиген) и соответствующая им гемолитическая сыворотка (антитело). РСК ставят в два приема: вначале соединяют антиген с испытуемой сывороткой крови, в которой отыскивают антитело, а затем добавляют комплемент. Если антиген и антитело соответствуют друг другу, то образуется иммунный комплекс, который связывает комплемент. При отсутствии в сыворотке антител иммунный комплекс не образуется и комплемент остается свободным. Поскольку процесс адсорбции комплемента комплексом визуально невидимый, то для выявления этого процесса добавляют гемсистему. Реакцию учитывают следующим образом. Если в первой (баксистеме) комплемент связался, то при добавлении гемсистемы гемолиз эритроцитов не произойдет – реакция положительная. Если же комплемент не связался в первой системе из-за отсутствия антител, то он свяжется с гемсистемой, в результате чего произойдет гемолиз эритроцитов – реакция отрицательная.

Антигены для РСК готовят из убитых и разрушенных микробов, чаще путем экстрагирования.

РСК широко используют для диагностики бруцеллеза, сапа, риккетсиозов, ящура и многих других.

Реакция длительного связывания комплемента (РДСК). Это вариант обычной РСК, но отличающийся тем, что первая фаза реакции протекает в течение 16–18 ч на холоде (4°С). В таких условиях в первой системе в комплексе антиген – антитело – комплемент дополнительно связываются и криофильные (холодовые) антитела, что повышает чувствительность реакции. Этот вариант используют для диагностики бруцеллеза, кампилобактериоза и др.

Реакция связывания комплемента (РСК) впервые описана Борде и Жангу (1901). В отличие от РА и РП при РСК соединение антигена с антителом проявляется только в присутствии третьего компонента – комплемента.

Реакция образования комплекса, Антиген – антите Ло – комплемент – невидимая. Чтобы выявить указанное взаимодействие компонентов реакции, используют дополнительную индикаторную систему, которая по своей наглядности проявления косвенно отражает результат взаимодействия в первой системе. Таким образом; в РСК участвуют две системы: 1) бактериолитическая (диагностическая) и 2) гемолитическая (вспомогательно-индикаторная), которая позволяет установить, произошло ли связывание комплемента в первой системе. Ранее в качестве, антигена использовали взвесь бактерий, и в положительных случаях происходил их лизис (бактериолиз), поэтому первая система получила название бактериолитической. Следовательно, в основу РСК легли два явления – бактериолиз и гемолиз.

РСК осуществляют в два этапа. Сначала готовят бактериолитическую систему – в пробирках смешивают по 0,5 мл исследуемую инактивированную сыворотку с антигеном, добавляют комплемент в строго определенном количестве (титре). Смесь антиген – антитело (сыворотка) – комплемент (бактериолитическая система) помещают в водяную баню (или термостат) при 37–38 °С на 20–40 мин. Далее приступают ко второму этапу реакции – во все пробирки добавляют компоненты второй гемолитической системы и вновь ставят в водяную баню на 15–20 мин. Затем учитывают предварительный результат (есть или нет гемолиза), оставляют при комнатной температуре до следующего дня и производят окончательный учет РСК. Отсутствие гемолиза (положительный диагностический результат) свидетельствует, что в испытуемой сыворотке имеются антитела, специфичные взятому антигену, комплекс антиген – антитело в первой системе образовался, комплемент связался. Добавляют компоненты второй системы – гемолизин и эритроциты, которые один по отношению к другому тоже являются антигеном (эритроциты) и антителом (гемолизин) и взаимодействуют в присутствии комплемента. Если же в исследуемой сыворотке нет антител, специфичных к взятому антигену, комплекс антиген – антитело не образуется и комплемент в первой бактериолитической системе не адсорбируется, остается в пробирке свободным, то при добавлении второй (гемолитической) системы комплемент взаимодействует с комплексом антиген – антитело (гемолизин – эритроциты) и происходит гемолиз (лизис эритроцитов). Диагностический результат отрицательный. Таким образом, в РСК участвуют 5 компонентов: антиген, антитело (исследуемая сыворотка), комплемент, гемолизин, взвесь эритроцитов барана. Для разведения всех компонентов используется электролитная среда–физраствор NaС1.

Для постановки РСК в диагностической лаборатории необходимо следующее: пробы сывороток от животных, поступившие в лабораторию для исследования; две сыворотки заведомо позитивные (стандартные, гипериммунные, обеспечивающие положительный результат – для контроля) и две нормальные сыворотки от здоровых животных – также для контроля (все сыворотки в разведении 1: 10 инактивируют для разрушения их собственного комплемента нагреванием в водяной бане при 56–58 °С 30 мин); антиген в разведении согласно титру (указанному биофабрикой на упаковке); комплемент (сыворотка морской свинки) в разведении соответственно установленному титру (при титрации); гемолизин в рабочем титре; взвесь эритроцитов барана в разведении 1: 40, физиологический раствор, градуированные пипетки различной емкости, пробирки, штативы, водяная баня, резиновые груши.

Реакция связывания комплемента (РСК) – это метод серологического анализа, который по своей чувствительности сравним с методами преципитации, агглютинации и нейтрализации. РСК представляет собой метод, где используются две системы антиген-антитело:

первая – специфическая;

вторая – индикаторная (гемолитическая).

Для проведения РСК необходимы 5 компонентов: диагностируемый антиген, диагностические антитела, антиген-индикатор (эритроциты барана), индикаторные антитела (кроличьи гемолизины), комплемент.

Специфическое взаимодействие антигена и антитела сопровождается связыванием комплемента. Образовавшийся комплекс визуально не проявляется. В качестве индикатора используется гемолитическая система. Гемолитическая сыворотка сенсибилизирует эритроциты к действию комплемента, в присутствии которого происходит лизис эритроцитов (гемолез). Если гемолиза нет, значит комплемент связан первой системой, и, следовательно, антиген в ней соответствует антителу – положительный ответ. Если антитело не соответствует антигену, комплекс не образуется и комплемент, оставаясь свободным, соединяется со второй системой, вызывая гемолиз – реакция отрицательная.

Для постановки РСК все ингредиенты реакции подготавливают и титруют до проведения основного опыта.

Сыворотку (больного или диагностическую) накануне проведения реакции прогревают на водяной бане при температуре 56ºС в течение 30 мин для инактивации ее собственного комплемента. Некоторые сыворотки, особенно иммунизированных животных, обладают антикомплементарными свойствами, т.е. способностью связывать комплемент в отсутствии гомологичного антигена. Антикомплементарность устраняют путем обработки их углекислым газом, прогреванием при температуре 57-58ºС, однократным замораживанием при температуре -20ºС или -70ºС и удалением осодка центрифугированием, добавлением к сыворотке комплемента в объеме 1:10 сыворотки и прогреванием ее после инкубации на холоде в течение 18-20 ч. Для предотвращения антикомплементарности сывороток их хранят в лиофилизированном виде или замороженном состоянии при низких температурах.

Антигеном для РСК могут быть культуры различных убитых микроорганиз мов, их лизаты, компоненты бактерий, патологически измененных и нормальных органов, тканевых липидов, вирусы и вируссодержащие материалы. Многие антигены из микроорганизмов получают производственным путем. Антикомплементарность антигенов устраняют при помощи таких методов, как термолиз (многократное замораживание и оттаивание), обработка жирорастворителями (эфиром, хлороформом, ацетоном), спиртами (метанолом, этанолом) и т.д.

В качестве комплемента используют сыворотку морской свинки, взятую непосредственно перед опытом; можно также применять сухой комплемент. Чтобы получить основной роаствор для последующего титрования, комплемент разводят 1:10 изотоноческим раствором натрия хлорида.

Эритроциты барана используют в виде 3 взвеси на изотоническом растворе натрия хлорида. Кровь (100-150 мл) берут из яремной вены, помещают в стерильную банку со стеклянными бусами, дефибринируют путем встряхивания в течение 10-15 мин и фильтруют через 3-4 слоя стерильной марли для удаления фибрина. Эритроциты отмывают 3 раза изотоническим раствором натрия хлорида, доливая его к осадку эритроцитов до первоначального объема крови. Эритроциты можно хранить 5-6 дней при температуре 4-6ºС. Срок хранения эритроцитов увеличивается при их консервировании с формалином.

Гемолитическую сыворотку для РСК получают следующим образом Иммунизируют кроликов путем введения им в вену уха 50% взвеси отмытых эритроцитов барана (по 1 мл 4-6 раз через день). Через 7 дней после последней инъекции получают пробную сыворотку. Если титр сыворотки не ниже 1:1200, то делают кровопускание. Сыворотку прогревают 30 мин при температуре 56ºС. Для предупреждения бактериального пророста в гемолитическую сыворотку добавляют консервант (мертиолят 1:10000 или 1 борную кислоту).

Гемолитическая система состоит из смешанных в равных объемах гемолитической сыворотки (взятой в тройном титре) и 3 взвеси эритроцитов барана. Для сенсибилизации эритроцитов гемолизинами смесь выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 30 мин.

Титрование гемолитической сыворотки. Сыворотку титруют путем соединения 0,5 мл ее (в разведениях 1:600, 1:1200, 1:1600, 1:3200 и т.д.) с 0,5 мл 3 взвеси эритроцитов и 0,5 мл свежего комплемента в разведении 1:10. Объем смеси для реакции в контрольных пробирках доводят до 1,5 мл, добавляя изотонический раствор натрия хлорида. Результаты реакции учитывают через 1 ч инкубации при температуре 37ºС. Титром гемолитической сыворотки считают ее наибольшее разведение, вызывающее полный гемолиз. Хранят сыворотку в лиофилизированном виде.

Схема титрования гемолитической сыворотки

Титрование комплемента. Перед проведением опыта основной раствор комплемента (1:10) разливают в ряд пробирок от 0,05 до 0,5 мл и добавляют в каждую изотонический раствор натрия хлорида, доводя объем жидкости до 1,5 мл. Пробирки помещают в термостат при температуре 37ºС на 45 мин, затем добавляют в них гемолитическую систему и выдерживают в термостате в течение 30 мин, после чего определяют титр комплемента.

Для опыта берут рабочую дозу комплемента (содержащуюся в объеме 0,5 мл), которая выше титра на 20-30%.

Схема титрования комплемента

Термостат при температуре 37ºС в течение 45 мин

Термостат при температуре 37ºС в течение 30 мин

Титрование антигена. Антигены, используемые для РСК могут адсорбировать какое-то количество комплемента, т.е. обладать антикомплементарными свойствами. Поэтому перед проведением опыта антигены титруют в присутствии рабочей дозы комплемента. В меньшей степени антикомплементарные свойства выражены у специфических антигенов, выпускаемых производственным путем. Их титр определяют не перед каждым опытом, а один раз в месяц, учитывая возможность его уменьшения в процессе хранения.

Для определения титра антигена его разливают в ряд пробирок в уменьшающемся количестве от 0,5 до 0,05 мл, доводя объем в них до 1 мл путем добавления раствора натрия хлорида. Затем в каждую пробирку добавляют 0,5 мл рабочей дозы комплемента и помещают их в термостат на 1 ч при температуре 37ºС. После этого во все пробирки добавляют по 1 мл гемолитической системы, снова выдерживают их в течение 1 ч в термостате и учитывают результаты реакции.

Титром антигена считают наименьшее его количество, при котором наступает полный гемолиз. Для РСК используют рабочую дозу антигена, составляющую примерно 1/2-1/3 титра. Антигены, в присутствии которых титр комплемента уменьшается более чем на 30%, непригодны для реакции.

Схема титрования антигена

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Проведение основного опыта РСК. Общий объем ингредиентов реакции – 2,5 мл, объем рабочей дозы каждого из них – 0,5 мл. В первую пробирку вносят сыворотку в соответствующем разведении, антиген и комплемент, во вторую – сыворотку в соответствующем разведении, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль сыворотки), в третью – антиген, комплемент и изотонический раствор натрия хлорида (контроль антигена). Одновременно готовят гемолитическую систему, смешивая по 2 мл гемолитической сыворотки в тройном титре (по отношению к указанному в инструкции) и 3% взвеси эритроцитов барана (по отношению к исходному объему крови). Пробирки выдерживают в термостате при температуре 37ºС в течение 1 ч, затем в первые 3 пробирки (первая система) добавляют по 1 мл гемолитической системы (вторая система). После тщательного смешивания ингредиентов пробирки вновь помещают в термостат на 1 ч при температуре 37ºС.

Схема проведения основного опыта РСК

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Термостат при температуре 37ºС в течение 1 ч

Результаты реакции учитывают предварительно – после извлечения пробирок из термостата и окончательно – после пребывания их в течение 15-18 ч в холодильнике или при комнатной температуре.

При окончательном учете интенсивность реакции выражают плюсами: (++++) – резко положительная реакция, характеризующаяся полной задержкой гемолиза (жидкость в пробирке бесцветная, все эритроциты оседают на дно); (+++, ++) – положительная реакция, проявляющаяся усилением окраски жидкости вследствие гемолиза и уменьшением количества эритроцитов в осадке; (+) – слабо положительная реакция (жидкость интенсивно окрашена, на дне пробирки незначительное количество эритроцитов). При отрицательной реакции (–) наблюдается полный гемолиз, жидкость в пробирке имеет интенсивно розовую окраску (лаковая кровь).

Предложен ряд модификаций РСК, отличающихся повышенной чувствительностью и меньшим объемом используемых ингредиентов. Так, например, при вирусологических исследованиях объем ингредиентов для РСК на холоде – 1 мл. Для капельной РСК берут 1 каплю сыворотки + 1 каплю антигена + 1 каплю комплемента + 2 капли гемолитической системы.

Реакция связывания комплимента нашла самое широкое распространение в микробиологической и серологической диагностике.

С помощью РСК обнаруживают комплементсвязывающие антитела в сыворотке крови больных сифилисом, сапом, хронической гонореей, риккетсиозами, вирусными заболеваниями и др.

Особый интерес РСК представляет для клинической иммунологии. Реакцию применяют для выделения различных субпопуляций лимфоцитов, для выявления антигенов HLA на тромбоцитах, перевиваемых лимфобластах, фибробластах, опухолевых клетках и тромбоцитоспецифических антигенов, а также соответствующих антител.

РСК широко используют для лабораторной диагностики венерических болезней, риккетсиозов, вирусных инфекций. Реакция протекает в две фазы. Первая фаза - взаимодействие антигена и антител при обязательном участии комплемента. Вторая - выявление результатов реакции при помощи индикаторной гемолитической системы (эритроциты барана и гемолитическая сыворотка). Разрушение эритроцитов гемолитической сывороткой происходит только в случае присоединения комплемента к гемолитической системе. Если же комплемент адсорбировался ранее на комплексе антиген-антитело, то гемолиз эритроцитов не наступает. При наличии в исследуемой сыворотке антител , комплементарных антигену, образующийся комплекс антиген-антитело связывает (адсорбирует) на себе комплемент. При добавлении гемолитической системы гемолиза не происходит (задержка гемолиза ) , т.к. весь комплемент израсходован на специфическую связь комплекса антиген-антитело, а эритроциты остались неизменными. При отсутствии в сыворотке антител , комплементарных антигену, специфический комплекс антиген-антитело не образуется и комплемент остается не связанным. Поэтому при добавлении гемолитической системы комплемент присоединяется к ней. Результатом реакции в данном случае будет гемолиз эритроцитов - в пробирках образуется так называемая «лаковая» кровь.

Рис. 6. Схема РСК: а - индикаторная система (эритроциты барана и антитела к ним) в присутствии комплемента определяется в виде гемолиза; б - с сывороткой больного диагностикум (Аг) образует иммунные комплексы и активирует комплемент, результат - задержка гемолиза; в - в сыворотке здорового человека антител нет, комплемент активируется индикаторной системой, результат - гемолиз.

Реакции с применением меченных ат и аг

Реакции с использованием меченных антител и антигенов составляют основу методов экспресс-диагностики инфекционных заболеваний, так как выявляют минимальное содержание Аг и Ат в исследуемых образцах. В качестве меток могут быть использованы различные ферменты, красители флюорохромы и изотопы.

Реакция иммунофлюоресценции (РИФ) Данный метод является экспрессным и высокочувствительным. Существуют две его разновидности. При прямом методе к исследуемой взвеси микробов, фиксированной на стекле, добавляют сыворотку, меченную флуорохромом. Образующийся комплекс антиген-антитело при освещении ультрафиолетовыми (сине-фиолетовыми) лучами дает ярко-зеленое свечение . При непрямом РИФ используют обычные диагностические сыворотки против какого-либо вида микробов. Добавление этой сыворотки к испытуемой взвеси микробов вызывает образование комплекса антиген-антитело. Этот комплекс выявляется с помощью универсальной флюоресцирующей сыворотки, содержащей антитела к гаммаглобулиновой фракции крови того вида животного, от которого была получена диагностическая сыворотка. Светящийся комплекс выявляют при люминесцентной микроскопии.

Рис. 7. Реакция иммунофлюоресценции (схема).

Иммуноферментный анализ (ИФА) В основе иммуноферментного анализа лежит известная иммунная реакция антигена и антитела. Один из этих реагентов является определяемым веществом, а другой - узнающим, обладающим известной стандартной специфичностью (избирательностью) по отношению к определяемому веществу. Для выявления образовавшихся иммунных комплексов (антиген-антитело) используется фермент , которым предварительно метится узнающий компонент (антиген или антитело). Сам фермент, естественно, не виден, поэтому визуализация присутствия вещества, определяемого методом ИФА, достигается применением посредника - хромогена . Это особое химическое соединение, которое хорошо растворимо в воде, и раствор которого бесцветен. Превращение бесцветного хромогена в цветное вещество хромофор происходит под действием фермента, для которого хромоген является субстратом.

Рис. 8. Иммуноферментный анализ (схема).

Аутоантигены - вещества, обладающие способностью вызывать иммунные реакции в организме, из которого они получены. Их содержат мозг, хрусталик глаза, сперматозоиды, паращитовидные железы, гомогенаты семенной железы, кожи, почек, печени и других тканей. Так как в обычных условиях аутоантигены не приходят в соприкосновение с иммунными системами организма, антитела к подобным клеткам и тканям не образуются. Однако при повреждении этих тканей аутоантигены могут всасываться и вызывать образование антител, оказывающих повреждающее действие на соот­ветствующие клетки. Аутоантигены могут возникать также из клеток некоторых органов и тканей под влиянием охлаждения, медикаментозного воздействия, вирусных инфекций, бактериальных бел­ков и токсинов, например стрептококков, стафилококков, микобактерии туберкулеза, и других факто­ров. Они образуются в этом случае вследствие нарушения видовой специфичности собственных антигенов организма.

Антитела, будучи сложными гликопротеидными молекулами, сами по себе также являются антигенами. В их составе различают три типа антигенных детерминантов (элитипов): изотипы, аллотипы и идиотипы.

Изотипы - детерминанты, по которым различаются классы и подклассы тяжелых цепей и вариан­ты каппа- и лямбда- легких цепей.

Аллотипы - детерминанты, кодируемые аллелями данного иммуноглобулинового гена.

Идиотипы - антигенные детерминанты, образуемые активными центрами молекул антител.

На долю класса IgG приходится около 75% общего количества всех иммуноглобулинов сыворотки крови человека.